Биогенез фотосинтетического аппарата и его регуляция

Структурная организация и биогенез хлоропласта

Строение хлоропласта и реакции фотосинтеза

Хлоропласт (ХП) представляет собой одну их разновидностей специфических органелл растительной клетки - пластид, в которых происходит фотосинтез. Схематическое изображение ХП показано на рис. 2.1.

Число ХП в клетках различных растений относительно постоянно. У высших растений в одной клетке насчитывается от 20 до 100 зеленых пластид. ХП имеет форму овального тела 5-10 мкм длиной и 2-3 мкм в диаметре. Внутреннее строение ХП, их ультраструктура были раскрыты с использованием электронного микроскопа [179]. ХП высших растений обладают высокопроницаемой наружной мембраной и менее проницаемой внутренней, в которую встроены специальные транспортные белки. Толщина

Строение хлоропласта [178] каждой из мембран составляет 7,5—10,0 нм, между ними находится узкое межмембранное пространство размером 10-30 нм

Рис. 2.1. Строение хлоропласта [178] каждой из мембран составляет 7,5—10,0 нм, между ними находится узкое межмембранное пространство размером 10-30 нм. Эти мембраны отделяют внутреннее пространство ХП от цитоплазмы клетки. Внутренняя мембрана окружает строму - вне-мембранное пространство ХП, в котором содержатся молекулы РНК, ДНК, рибосомы, крахмальные зерна и многочисленные ферменты, осуществляющие реакции ассимиляции СО2. В строме расположена сложно организованная мембранная система, которая образована уплощенными мембранными «мешками» -тилакоидами (греч. «тилакоидес» - мешковидный). Внутренние полости тилакоидов сообщаются между собой, образуя люминальное пространство, которое отделено от стромы непроницаемой для ионов тилакоидной мембраной.

Большинство тилакоидов образует стопки - граны, остальные расположены в строме, при этом часть из них может входить в состав гран. Типичный ХП содержит от 40 до 60 стопок гран диаметром 0,3-0,6 мкм [180]. Толщина тилакоида составляет примерно 20 нм [181]. В тилакоидной мембране происходят световые реакции фотосинтеза - процессы преобразования энергии солнечного света в энергию химических связей. Тилакоидная мембрана представляет собой липидный бислой [182] и содержит мультиферментные комплексы, осуществляющие разделение зарядов и перенос электрона через мембрану: комплексы фотосистемы 1 (ФС 1), фотосистемы 2 (ФС 2), цитохромный bjf комплекс (Cyt b6/f АТФ-синтазу (ATP) (рис. 2.2, см. цветную вклейку).

Характерной особенностью тилакоидных мембран является их сильно выраженная латеральная гетерогенность, обусловленная неравномерным распределением пигмент-белковых комплексов (ПБК). В составе интегральных мембранных белков имеется много гидрофобных аминокислот. Это создает безводную среду и делает мембраны стабильнее. Многие белки тилакоидных мембран построены в виде векторов и граничат с одной стороны со стромой, а с другой - с внутренним пространством тилакоида.

Тилакоидные мембраны имеют отрицательный поверхностный заряд, причем на наружной поверхности мембран плотность 34

этих зарядов выше. Поверхностный заряд играет важную роль в процессе формирования гран. Катионы, экранируя отрицательные заряды на поверхности мембран, уменьшает силу их отталкивания, что ведет к слипанию мембран и образованию гран (процесс стэкинга).

Согласно модели [183], 20% мембран существует в виде стромальных ламелл, а 80% - в виде гранальных стопок. Линейный транспорт электронов происходит в гранах, где ФС 2, расположенная в спаренных участках, взаимодействует с ФС 1, локализованной в краевых, выдающихся в строму участках гранальных дисков. Циклический транспорт электронов происходит в стромальных участках, которые в основном содержат комплексы ФС 1.

Вопрос о пространственной организации мембранной системы в ХП и о связи между тилакоидами гран и тилакоидами стромы в настоящее время еще окончательно не решен. Наиболее известна винтовая, или гранулярно-решетчатая, модель организации тилакоидной системы ХП (цит. по [179]), которая была предложена D. J. Jr. Paolillo (1970) на основе оригинальных наблюдений, сделанных von D. Wettstein (1959), J. Heslop-Harrison (1963) и W. Wehrmeyer(1964). Согласно этой модели, внутренние пространства всех тилакоидов соединены между собой. Таким образом, в ХП имеется как бы два раздельных пространства -внутреннее (внутри тилакоидов) и внешнее (вне тилакоидов). Последняя форма модели предполагает двустороннюю структуру, состоящую из цилиндрического тела граны, построенной из сложенных один на вершине другого дисков, вокруг которого расположены ламеллы стромы, закрученные как правосторонние лопасти винта (helices). Граны контактируют друг с другом через эти ламеллярные лопасти, которые повернуты на 20° относительно стэков граны и осуществляют многочисленные контакты с последовательными слоями в гране через перфорированные отверстия, расположенные по контуру стэков [184].

Следует, однако, отметить, что у большинства водорослей гран нет, а ламеллы собраны в группы (пачки) по 2-8 штук. Кроме того, не у всех высших растений ХП имеют гранальную структуру. Так, у ряда растений, например у кукурузы, в листьях имеются два вида ХП: в клетках мезофилла содержатся мелкие ХП гранального строения, а в клетках обкладки, окружающих листовые сосудистые пучки, - крупные ХП, не содержащие гран.

Ультраструктурная организация тилакоидных мембран в основном соответствует общепринятой жидко-мозаичной модели, предложенной S. I. Singer, С. L. Nicolson [185]. Основу ее составляет липидный бислой, в который погружены ПБК. Липиды фотосинтетических мембран представлены в основном четырьмя группами: дигалактозилдиацилглицеринами, сульфохи-новозилдиацилглицеринами, фосфатидилглицеринами и моно-галактозилдиацилглицеринами [26]. Первые три группы липидов образуют липидный бислой, а моногалактозилдиацилглицери-ны, в силу своих физико-химических свойств не способные формировать плоский бислой в водной среде из-за образования инвертированных цилиндрических или сферических структур, окружают ПБК, стабилизируя их структуру [186]. Специфический липидный состав фотосинтетических мембран, включающих 75% электронейтральных галактолипидов, 15% фосфолипидов и 10% сульфолипидов с большим содержанием ненасыщенных жирных кислот, обусловливает высокий уровень текучести тилакоидных мембран [26]. Однако это свойство мембран зависит также от соотношения белков и липидов и различается в тилакоидах стромы и тилакоидах гран [26].

Белковые компоненты фотосинтетических мембран представлены примерно 75 полипептидами с М. м. от 10 до 140 кДа. По характеру расположения в мембране они делятся на белки интегральные, пронизывающие фотосинтетические мембраны насквозь, и белки периферические, связанные с поверхностью мембраны слабыми нековалентными связями [187].

В тилакоидной системе ХП высших растений существенную долю составляют пигменты. Они представлены Хл а, Хл Ь, каротиноидами, фикобилинами. Большую часть пигментов составляет Хл а [186]. Функциональная гетерогенность молекул Хл обусловлена синтезом различных форм Хл в «центрах биосинтеза Хл» нескольких типов. Гипотеза о локализации биосинтеза в специальных центрах, выдвинутая А. А. Шлыком еще в 1975 г., 36

в настоящее время подтверждена работами ряда авторов [26,188, 189]. Согласно ей, биосинтез Хл осуществляется не диффузно во всем объеме пластиды, а в ее особых структурных центрах, обеспеченных соответствующими ферментами. Предполагается, что в этих центрах может осуществляться синтез всех предшественников Хл, включая и молекулы Хл а.

Содержащиеся в мембранах пигменты образуют ПБК, которые довольно тесно связаны с липидным окружением. Большинство авторов придерживаются мнения, что весь Хл фотосинтетических мембран содержится в этих комплексах [186]. Однако в ряде работ утверждается, что пигменты могут связываться с липидами или находиться в свободном состоянии. В [26] был обнаружен Хл а, связанный с фосфоглицерином и частью моно-галактозилдиацилглицерина, а в [190] была идентифицирована форма Пд, не связанного с белком.

В сформированных фотосинтетических мембранах выделяют пять основных ПБК, погруженных в липидный матрикс и обеспечивающих светосбор, электронный транспорт, транслокацию протонов и синтез АТФ: комплексы ФС 1 и ФС 2, ССК 2, Cyt b6/f и АТФ-синтазный комплекс [28, 186]. Три из них содержат Хл -это ФС 1, ФС 2 и светособирающий Хл а/b комплекс ПБК ФС 2 (ССК 2). В остальных двух комплексах - АТФ-азном и Cyt b6/f -хлорофилловые пигменты отсутствуют.

К настоящему времени накоплено большое количество данных, позволяющих более детально проанализировать биохимический состав основных супрамолекулярных комплексов, а также описать их свойства и функции. Эти данные получены в результате использования современной экспериментальной техники: систем неденатурирующего электрофореза, иммунохимических и молекулярно-биологических методов. Выделение генов, кодирующих синтез мембранных белков, позволяет установить аминокислотные последовательности на основании изучения терминальных последовательностей нуклеотидов.

Вышеперечисленные комплексы входят в состав тилакоидных мембран и образуют так называемую Z-схему транспорта электрона в ХП (рис. 2.3). Она была постулирована в 1960-1961 гг.

Lk)

ОС

Пласто-

Схема электрон-транспортной цепи хлоропластов [197]

Рис. 2.3. Схема электрон-транспортной цепи хлоропластов [197]

несколькими группами исследователей [191, 192] и до настоящего времени дополняется и детализируется [193]. Смысл ее заключается в том, что «подъем» электрона против градиента электрохимического потенциала от начального донора - воды (потенциал окисления +810 мВ) до терминального акцептора - НАДФ (потенциал восстановления -30 мВ) осуществляется двумя последовательными фотоактами. Каждый из них сенсибилизируется отдельной фотосистемой (ФС 1 или ФС 2), каждая из которых содержит собственный реакционный центр (РЦ), включающий фотохимически активный Хл а, первичный донор и первичный акцептор электрона [194].

ФС 2 представляет собой сложный пигмент-белковый энзиматический комплекс (рис. 2.4; рис. 2.5, см. цветную вклейку), погруженный в тилакоидную мембрану и насквозь пронизывающий ее. Функционально его определяют как вода-пластохинон-оксидоредуктаза [195]. Условно комплекс ФС 2 можно разделить натри основных структурно-функциональных блока: 1) внутренний светособирающий комплекс ФС 2 (ССК ФС 2), основная

Схема строения ФС 2 [197

Рис. 2.4. Схема строения ФС 2 [197, 198] роль которого заключается в улавливании квантов света и передаче энергии электронного возбуждения пигментов на специализированный Хл-содсржащий фотохимический РЦ; 2) фотохимический РЦ ФС 2, который превращает энергию возбуждения Хл а в энергию разделенных зарядов; 3) кислородвыделяющий комплекс (КВК), который сам сначала многократно окисляется с помощью Р680+, а затем отнимает недостающие электроны от молекул воды, в результате чего образуется молекулярный кислород.

ССК ФС 2 (LHCII) - основной светособирающий пигмент-протеиновый комплекс, которым наиболее обогащены тилакоидные мембраны. Соотношение трех основных ПБК ХП (ФС 1:ФС 2:ССК 2) составляет 1:2:8. ССК 2 содержит около 75% Хл

Таблица 2.1. Антенные комплексы эукариот [196J

Компонент

Количество трансмембранных а-спиралей

Молекулярная масса, кДа

Ген

Связанные кофакторы

LHCI-ТИП I

3

22

Lhcal

LHCI-белки связывают Хл а и b и некоторые каротиноиды

LHCI-тип II

3

25

Lhca2

LHCI-тип III

3

26

Lhca3

LHCI-тип IV

3

22

Lhca4

LHCII-тип I

3

25

Lhcbl

LHCII-протеины связывают 7 молекул Хл а, 5 - Хл Ь, 2 лютеина, 1 неоксантин

LHCII-тип II

3

25

Lhcb2

LHCII-тип III

3

24

Lhcb3

СР29 (LHCIIa)

3

28

Lhcb4

Связывает 6 молекул Хл а, 2 - Хл Ь, ксантофиллы

СР26 (LHCIIc)

3

27

Lhcb5

Связывает 6 молекул Хл а, 3 - Хл Ь, ксантофиллы

СР24 (LHCIId)

3

23

Lhcb6

Связывает 6 молекул Хл а, 4 - Хл Ь, ксантофиллы

Примечание. Молекулярные массы даны на основании аминокислотных последовательностей, они различаются для разных организмов. Гены всех белков светособирающих комплексов кодируются в ядре.

и 1/3 белков мембран ХП. В настоящее время доказано, что ССК 2 является универсальным регуляторным ПБК, который включается в систему кратковременных и более длительных адаптационных перестроек ФСА [196]. Общий пул ССК 2 состоит из трех субъединиц -1, II, III, соотношение которых у высших растений зависит от условий выращивания. Отношение Хл/бе-лок в ССК 2 составляет 12-13 молекул пигмента на одну молекулу белка. Фонд пигментов, связанных с белком, представлен Хл а и Хл b почти в равных количествах, а также ксантофиллами - неоксантином и лютеином. Молярное соотношение четырех пигментов - 7:6:1:2.

Модель организации светособирающей антенны в димерном комплексе ФС 2 [196]

Рис. 2.6. Модель организации светособирающей антенны в димерном комплексе ФС 2 [196]

В табл. 2.1 приведены данные о молекулярных массах пептидов, входящих в состав ССК ФС 2 (LHC11) и ССК ФС 1 (LHCI).

Комплексы ССК 2 организованы в мембране в виде гомо-и гетеротримеров полипептидов. Их соотношение в настоящее время неизвестно, равно как и стехиометрия ССК 2 олигомеров в мембране относительно комплекса ФС 2. Предполагают, что четыре тримера ССК 2 связаны с димерным комплексом ФС 2 (модель представлена на рис. 2.6).

РЦ ФС 2 состоит из 6 молекул Хл а, 2 молекул Фф, 2 молекул 0-каротина и 1 молекулы Cyt Z>559 [197]. Две из шести молекул Хл образуют фотоактивный димер Р680, осуществляющий разделение зарядов. Другие две молекулы Хл непосредственно связаны с субъединицей кор-комплекса СР47 и выполняют функцию приема энергии электронного возбуждения в РЦ от ССК ФС 2. Структурной основой РЦ являются интегральные белки D1 и D2 с М. м. 32 и 34 кДа, несколько периферических полипептидов меньшей М. м. (около 10 кДа), а также Cyt Z>559. Белок D1 несет на себе первичный акцептор Фф и вторичный донор для РЦ ФС 2 Yz - молекулу Тир 161, а также молекулу Гис, принимающую электрон от КВК [200]. На белке D2 расположены неактивный Тир 160 и первичный хиноновый акцептор QA, принимающий электрон от Фф и передающий его на QB, который локализован на белке D1 [200]. Cyt 6559 состоит из двух белковых субъединиц аир (молекулярные массы 9 и 4 кДа соответственно) и одной молекулы гема [198]. ФС 2 содержит еще ряд низкомолекулярных белков, которые исследованы недостаточно, но существование которых предполагается в связи с открытием их генов. В табл. 2.2 приведена характеристика всех известных полипептидов ФС 2 и их современные обозначения.

Согласно современным представлениям [201], первичные фотофизические и фотохимические реакции в ФС 2 протекают следующим образом. Молекулы антенного Хл, содержащегося в ССК ФС 2 и связанного с СР43 и СР47, поглощают кванты света и передают энергию электронного возбуждения на Р680. Молекула Р680 переходит в возбужденное состояние - Р680* и затем окисляется до Р680+ первичным электронным акцептором Фф а 42

(см. рис. 2.4) [195]. При этом окислительно-восстановительным превращениям подвергается только одна из двух молекул Фф, находящихся в РЦ [202]. В результате этого процесса, который протекает за несколько пикосекунд, происходит разделение зарядов [Р680+Фф“]. Молекула в таком состоянии находится лишь 10-8 с. Далее электрон переносится от Фф- на молекулу акцептора электрона QA (комплекс пластохинона с атомом Fe2+) за время 2 1О-10 с [201]. При этом теряется около 30% энергии, запасенной в результате первичного фотоакта, но образуется более стабильное состояние [Р680+Фф-А- (время жизни 1.5 10-4 с) [201]. Перенос электрона от QA к следующему акцептору хиноновой природы - QB (рис. 2.4) происходит за время порядка 240-7 с [203]. QB способен акцептировать два электрона и выполняет роль «двухэлектронного затвора» на участке между ФС 1 и ФС 2 [204]. Двукратное восстановление QB сопровождается присоединением двух протонов с образованием пластохинола QBH2. Константа связывания со специфическим центром в белковом компоненте ФС 2 велика только для формы QB“, но не для QBH2, поэтому пластохинол отделяется от полипептида D1 и может диффундировать к ФС 1.

В последнее время появились данные о гетерогенном характере первичного акцептора QA. По кривым окислительно-восстановительного титрования флуоресценции Хл в присутствии диурона выделяют быстровосстанавливающуюся высокопотенциальную (-250 мВ) и низкопотенциальную (0 мВ) формы QA, соответствующие двум типам ФС 2: а и 0 [205]. а-Центры обладают большой антенной и были обнаружены в гранальной области тилакоидов, в то время как 0-центры располагаются в ламеллярной области [206].

Доминирующая часть ФС 2 - a-центры. Кроме размера антенны ФС 2 различаются по характеристикам акцепторной стороны. Выделяют QB-восстанавливающие и QB-невосстанавливающие ФС 2. Qg-восстанавливающие (активные) РЦ ФС 2 тесно связаны с хиноновым акцептором, в то время как QB-невосстанавливающие (неактивные) РЦ не способны передавать

Таблица 2.2. Характеристика полипептидов ФС 2 [196]

Субъединица

Количество ТМ а-спиралсй

Молекулярная масса, кДа

Ген (C/N)

Функции и связанные кофакторы

PSII-A (D1)

ТМ (5)

39

psbA (С)

РЦ ФС 2, QB, Yz, Хл а, Фф, 1-2 Р-каротина

PSII-D (D2)

ТМ (5)

39

psbD (С)

РЦ ФС 2, QA, Yd, Хл а, Фф, 1-2 Р-каротина

PSII-E (Суt b559 а)

ТМ (1)

9

psbE (С)

РЦ ФС 2, b-гем, фотопротекция

PSII-F (Cyt b559 Р)

ТМ (1)

4

psbF (С)

РЦ ФС 2, b-гем, фотопротекция

PSII-1

ТМ (1)

4

psbl (С)

РЦ ФС 2, обеспечивает эффективную интеграцию полипептидов РЦ ФС 2

PSII-B (СР47)

ТМ (6)

56

psbB (С)

Внутр, антенна, 20 Хл а, 2-4 р-каротина

PSII-C (СР43)

ТМ (6)

51

psbC (С)

Внутр, антенна, 20 Хл а, 2-4 Р-каротина

PSII-H

ТМ (6)

8

psbH (С)

Регуляция электрон, переноса между QA и QB

PSII-J

ТМ(1)

4

psbJ (С)

PSII-K

ТМ(1)

4

psbK (С)

Необходим для стабильности комплекса ФС 2

PSII-L

ТМ (1)

4,5

psbL (С)

Участие в ОА-связывании

PSII-M

ТМ(1)

4

psbM (С)

PSII-N

ТМ(1)

4,5

psbN(C)

PSI1-T

ТМ (1)

4

psbT (С)

Обеспечивает эффективное замещение фотоповрежден-ного белка D1

PSI1-0 (ОЕЗЗ)

L

26

PsbO (N)

Стабилизация Мп кластера, Са++- и СГ-связывание

PSII-X

ТМ(1)

4

PsbX(N)

Локализован в ближайшем окружении РЦ ФС 2, возможно, связан с Cyt 6559, экспрессия генов светозависима

PSII-P (ОЕ23)

L

20

PsbP (N)

Са++- и СЕ-связывание

PSII-Q (ОЕ16)

L

16,5

PsbQ (N)

Са++- и С1_-связывание

PSII-R

ТМ (1?)

10

PsbR (N)

PSII-T*

L

3

PsbT (N)

PSII-W

ТМ(1)

6

PsbW(N)

Примечание. Молекулярные массы даны на основании аминокислотных последовательностей, они могут значительно отличаться от значений, получаемых при электрофоретическом разделении белков, а также быть отличными для различных организмов. ТМ - трансмембранный протеин, L - люменальный протеин, С и Y- хлоропластный и ядерный гены соответственно, РЦ ФС 2 - реакционный центр фотосистемы 2, Фф - феофитин, Q (хинон) и Y (тирозин) - акцептор и донор электронов соответственно. Y-тирозины расположены на D1 и D2 белках в высококонсервативных областях, составленных девятью аминокислотными остатками, на частях, экспонированных в люмен.

электроны на вторичный хиноновый акцептор [28, 207]. ФС 2а являются только Qg-восстанавливающими центрами и передают электроны на пластохиноновый пул и далее к ФС 1 [207]. ФС 2р гетерогенны и могут являться как Qg-восстанавливающими, так и Qg-невосстанавливающими центрами [208]. Было показано, что ФС 2а, активные и неактивные ФС 2g могут превращаться друг в друга [209]. Роль p-центров окончательно не ясна. Неактивные РЦ, по-видимому, являются резервным пулом активных ФС 2 [209] и участвуют в цикле репарации ФС 2, связанном с синтезом белка D1 [210]. ФС 2» также могут принимать участие в таких регуляторных процессах, как фосфорилирование белков и расстыковка гран.

Кроме вышеописанного транспорта электронов в ФС 2 существует альтернативный циклический транспорт электронов, включающий Cyt />559 [198, 205, 211]. В этом случае электроны от первичного хинонового акцептора QA передаются не на пластохиноновый пул, а донируются низкопотенциальной форме Cyt 6559, которая превращается в высокопотенциальную и, в свою очередь, восстанавливает Р680+ через редокс-активный Хл - Хл7 (см. рис. 2.4).

квк локализован в пигмент-белковом комплексе ФС 2 ближе к внутренней части тилакоидной мембраны (см. рис. 2.5 на цветной вклейке). С разрешением 3 А показано, что основу энзиматического центра КВК составляет многоядерный Мп3СаОх кластер, окисляемый катион-радикалом Р680 с участием первичного донора электрона Z - остатка тирозина-161, входящего в состав белка D1 [212]. Марганец-кальциевый кластер имеет форму куба, в котором ионы металлов связываются тремя ц-оксо-мостиками. Согласно модели Barber, расстояние между ионами металлов в кубоподобном кластере составляет около 2,7 А для Мп-Мп связи и около 3,4 А для Мп-Са2+ связи. Кубический кластер связывается моно-ц-оксо-мостиком с внешним четвертым ионом Мп, находящимся на расстоянии около 3,3 А. Лигандами Мп3СаО4 кластера являются четыре остатка: Asp342 белка D1 для Мпр Glu189 белка D1 и His332 белка D1 для Мп2 и Glu354 белка СР43 для Мп3. Лигандом для Са2+, по-видимому, является Ala344 46

белка D1, в то время как His337 белка D1 взаимодействует с молекулой кислорода О2 КВК кластера посредством водородной связи. Внешний Мп4 атом локализован в небольшом домене и имеет два непосредственных белковых лиганда: Asp170 белка D1 и Glu333 белка D1; с третьим остатком (Asp61 белка D1) он связывается, вероятно, через молекулы воды [212].

КВК может находиться в одном из пяти так называемых S-состояний: So, Sp S2, S3 и S4. При освещении КВК последовательно переходит из исходного состояния So в состояние S4, реагирующее с двумя молекулами воды с выделением О2, в результате чего вновь возвращается в So состояние и готово к новому циклу превращений [213]. Большинство S-переходов связано с окислением ионов Мп, в результате которого их валентность увеличивается от +2 до +3, +4 (Мп-оксид радикал) или +5 (Мп-оксо), а после накопления четырех окисленных эквивалентов марганцевый центр окисляет воду, что приводит атом Мп к исходной валентности.

Cyt b,/f комплекс, наряду с фотосистемами (ФС 1 и ФС 2), является одним из основных пигмент-белковых комплексов, локализованных в тилакоидной мембране ХП и вовлеченных в процесс фотосинтетической трансформации энергии. В электрон-транспортной цепи фотосинтеза цитохромный комплекс занимает положение между ФС 1 и ФС 2 (см. рис. 2.3), контролируя общую скорость транспорта электронов от первичного донора к терминальному акцептору и обеспечивая баланс между притоком электронов от ФС 2 (в случае нециклического транспорта) и ферредоксина (в случае циклического транспорта) и их оттоком из ФС 1. Важнейшей функцией цитохромного комплекса является сопряжение транспорта электронов по электрон-транс-портной цепи с формированием электрохимического потенциала протонов (ДцН+) на мембране тилакоида, который используется для синтеза АТФ. С точки зрения энзимологии Cyt b^/f комплекс является пластохинол-пластоцианин оксидоредуктазой, т. е. катализирует окисление двухэлектронного переносчика - пластохинона и восстановление одноэлектронного переносчика - пла-стоцианина [214].

Размеры стромальной части Cyt bjf комплекса в латеральной плоскости составляют 90 х 55 А (рис. 2.7, см. цветную вклейку), в люменальной - 120 х 75 А. В перпендикулярном мембране направлении размер Cyt комплекса составляет 100 А [215].

Имеются сведения о 10 субъединицах Cyt b^f комплекса (табл. 2.3) в стехиометрии один к одному, как показано для очищенного комплекса из Chlamidomonas reinhardtii [196]. Согласно данным рентгеноструктурного анализа [215], Cyt b6/f комплекс содержит в себе четыре большие субъединицы с молекулярной массой от 17 до 34 кДа (Cyt f Cyt Z>6, центр Риске (или протеин Риске), содержащий 2Fe-2S кластер и Qp-сайт (или субъединицу IV -suIV). Последняя не содержит простетических групп, но ее

Таблица 2.3. Полипептиды Cyt b6/f комплекса [196|

Субъединица

Среднеточечный потенциал

Количество ТМ а-спиралей

Молекулярная масса, кДа

Ген (C/N)

Функции и связанные кофакторы

Cyt/

+330/370

ТМ (1)

31

pet Л (С)

с-гем

Cyt b6

bh-50/80 Ц -160/170

ТМ (4)

24

pet В (С)

Вклад в связывание хинона, 2Ь-гема

Субъединица IV (suIV)

-

ТМ (3)

15

pet D (С)

Вклад в связывание хинона

Pet G

-

ТМ(1)

4

pet G (С)

Pet L

ТМ(1)

3

pet L (С)

Протеин Риске

+330/370

ТМ (1?)

19

Pet С (N)

Вклад в связывание хинона, 2Fe-2S

Pet М

-

ТМ(1)

4

PetM(N)

Субъединица V

-

S

18

(N)

-

15

-

ТМ

60

(N)

Киназа

Примечание. Cyt b6 включает два гемма — высоко- и низкопотенциальный, обозначаемые соответственно bh и b,. ТМ и S соответствуют трансмембранному расположению протеина и поверхностному со стороны стромы. Молекулярная масса приведена на основании аминокислотной последовательности зрелого белка, может отличаться от электрофоретических данных. С и V- кодирование хлоропластным и ядерным геномами соответственно.

аминокислотные остатки вместе с таковыми протеина Риске и Cyt b6 образуют сайты для присоединения хинона к протеиновому комплексу. Кроме того, Cyt b6/f комплекс содержит четыре малые гидрофобные субъединицы - Pet G, Pet L, Pet M, Pet N, что увеличивает его молекулярную массу до 217 кДа.

Полипептидные сиквенсы выявили гомологию белков Cyt b6 и suIV митохондриальному и бактериальному Cyt b с N- и С-тер-минальными доменами. Среднеточечные потенциалы субъединиц Cyt b^/f комплекса, гены, кодирующие белки, а также другие параметры приведены в табл. 2.3.

Вопрос о том, каков путь переноса электронов через комплекс, до сих пор остается спорным, однако наиболее вероятными в последнее время считаются варианты модели Q-цикла, впервые сформулированной Р. Mitchell [216]. Предполагается, что в комплексе Cyt b6/f центр связывания пластохинола QH2 находится вблизи внутренней поверхности тилакоидной мембраны, а место связывания пластохинона Q - возле наружной ее поверхности. Передача электронов от Cyt f к ПБК ФС 1 осуществляется диффундирующим переносчиком - пластоцианином, который способен тесно связываться с РЦ ФС 1. Пластоцианин представляет собой гидрофобный металлопротеин с молекулярной массой 10,5 кДа. Он диффундирует во внутренней среде тилакоидов со скоростью 10-8 см2 с-1 [197].

ФС 1 представляет собой сложный пигмент-белковый энзиматический комплекс (рис. 2.8; рис. 2.9, см. цветную вклейку), погруженный в тилакоидную мембрану и насквозь пронизывающий ее. ФС 1 является пластоцианин-ферредоксин оксидоредуктазой и осуществляет фотоиндуцированное окисление пласто-цианина, восстановление ферредоксина (Фд) и генерацию несимметричного трансмембранного распределения электрических зарядов.

Комплекс ФС 1 у высших растений состоит из двух частей: ядра (core) и светособирающего комплекса, ССК1 (LHC1). Последний не был найден в цианобактериях, соге-комплекс которых очень близок по составу к таковому для высших растений. Благодаря этому значительный объем информации относитель-

Схема строения ФС 1 [ 197]

Рис. 2.8. Схема строения ФС 1 [ 197]

но биохимической композиции ФС 1-соге был получен в результате исследования цианобактерий, которые более изучены генетически.

LHCI содержит приблизительно ПО молекул Хл и состоит из трех пулов: LHC-730, LHC-680A и LHC-680B, которые сформированы из полипептидов, кодированных четырьмя ядерными генами из семейства cab генов (см. табл. 2.1). Установлено, что 8 LHCI субъединиц расположено вокруг ФС 1-соге (модель их пространственного расположения приведена на рис. 2.10). Поскольку ФС 1-соге содержит 65-90 молекул Хл, то в нативном комплексе ФС 1, который содержит кроме него LHCI, на один реакционный центр (Р700) приходится около 200 молекул Хл [196].

В 1993 г. методами рентгеноструктурного анализа была получена первая структурная модель ФС 1 с разрешением 6 А, позже улучшенная до 4 А. В 2001 г. структура ФС 1 цианобактерий определена с разрешением 2,5 А [217]. Рентгеноструктурный анализ ФС 1 растений гороха (Pisum sativum) с разрешением 4,4 А был сделан в 2003 г. [218]. В 2005 г. на основе этих моделей была предложена структурная модель ФС 1 высших растений (см. рис. 2.9 на цветной вклейке) [219].

По существующим представлениям, комплекс ФС 1 имеет размер 11x11x7 нм и массу больше 300 кДа.

У цианобактерий ФС 1 существует в виде тримера, мономеры которого состоят из 12 субъединиц, 96 молекул Хл а, 22 молекул каротиноидов, 3 железо-серных [4Fe-4S] кластеров и 2 молекул фил-лохинона. У растений ФС 1 существует в виде мономера, образованного 14 субъединицами [219], 10 из которых (PsaA, PsaB, PsaC, PsaD, PsaE, PsaF, Psal, PsaJ, PsaK, PsaL) похожи на соответствующие субъединицы цианобактерий. В ФС 1 растений отсутствует 2 субъединицы, характерные для цианобактерий (PsaX и PsaM), но содержится 4 субъединицы (PsaG, PsaH, PsaN, PsaO), которых нет у цианобактерий (табл. 2.4, рис. 2.9).

Модель светособирающей антенны ФС 1 [196]

Рис. 2.10. Модель светособирающей антенны ФС 1 [196]

Таблица 2.4. Полипептиды ФС 1 [196]

Субъединица

Количество TM а-спиралей

Молекулярная масса, кДа

Ген (C/N)

Функции и связанные кофакторы

PSI-A (PsaA, la, PSI-A)

TM(ll)

83,0 (66)

psaA (С)

П700, Ао (Chi), А| (витамин К]), Fx [4Fe-4S], гетеродимер связывает около 100 молекул Хл а, 10-12 молекул Р-каротина;светосбор, разделение зарядов и стабилизация разделенной пары, фотопротекция

PSI-B (PsaB, lb, PS1-B)

TM(ll)

82,4 (66)

psaB (С)

То же совместно с PSI-A

PSI-C (PsaC, VII, PSI-C)

s

8,9 (8)

psaC (С)

2[4Fe-4S] (FA, FB), терминальный акцептор, донирует электроны к ферродоксину

PSI-D (PsaD, II, PSI-D)

s

15,6(15,8)

PsaD (N)

В контакте с ферредоксином и PSI-C обычный ЭПР сигнал, как у FA и FB, важна для создания всех субъединиц ФС 1-соге

PSI-E (PsaE, IV, PSI-E)

s

8,0

PsaE (N)

Облегчает интеграцию с Fd, важна для циклического электронного транспорта

PSI-F (PsaF, 111, PSI-F)

TM (1-2?)

15,7 (15,8)

PsaF (N)

В контакте с пластоциани-ном обеспечивает быстрый электронный транспорт от пластоцианина к П700

PS1-G (PsaG)

TM (1-2)

10-10,8

PsaG (N)

Взаимодействие с LHC1

PSI-H (PsaH, VI)

10,2-11

PsaH (N)

Взаимодействие с LHCI

PSI-I (Psal, IX)

TM(1)

4,3 (3,4)

psal (C)

Нормализует организацию PSI-L

PS1-J (PsaJ, VIII)

TM(1)

4,4 (3,0)

psaJ (C)

Нормализует организацию PSI-F

PSI-K (PsaK)

TM (2)

8,5 (5,1)

PsaK (N)

PSI-L (PsaL, V)

TM (2)

16,6 (14,3)

PsaL (N)

Способствует тримериза-ции ФС 1

PSI-M (PsaM)

TM(1)

3,4 (2,8)

PsaM

Циклический электронный транспорт

PSI-N (PsaN)

L

9

PsaN (N)

Комплекс ФС 1 (см. рис. 2.8) содержит около 200 молекул Хл, каротиноиды, 3 Fe-S-центра и одну или более молекул хинона [196]. В состав РЦ ФС 1 входят первичный донор электронов Р700 и акцепторы Ag, Ар X, А, В. Р700, открытый в 1956 г., представляет собой димер - две молекулы Хл а, локализованные в пределах субъединиц PsaA и PsaB около люминальной поверхности, расстояние между центрами которых составляет 7-9 А. Переносчик Ад является молекулой Хл а, в то время как переносчики X, А, В представляют собой 4Fe-4S кластеры, расположенные в месте контакта PsaA и PsaB субъединиц и периферической субъединицы PsaC [196]. Относительно химической природы акцептора Aj в настоящее время наиболее распространено мнение, что он представляет собой витамин Kj (или филлохинон) [220].

Перенос электрона в ФС 1 происходит по следующей схеме: Р700—>-Ад—«А]—>Х—>(А, В). Поглощение кванта света переводит Р700 в нижнее синглетное возбужденное состояние и приводит к образованию катион-радикала. Перенос электрона на первичный фотохимический акцептор Ад осуществляется быстрее, чем за 10 пс, на Aj - за 20-50 пс. Время переноса электрона на X составляет, по разным оценкам, от 200 пс до 20-50 нс, а на акцепторы А и В - 170 нс [197]. Величина окислительно-восстановительного потенциала у переносчика X равна 705 мВ, а у акцепторов А и В - соответственно -540 и -590 мВ. Переносчики А и В не находятся в линейной цепи друг за другом, а работают параллельно, образуя вместе конечный акцептор электронов в РЦ ФС 1 [221].

Перенос электрона от железо-серных центров А и В к химически стабильному акцептору НАДФ+ опосредуется так называемым «растворимым» Фд и ферментом флавопротеиновой природы ФдОР [222]. НАДФ+ при восстановлении принимает два электрона и один протон.

АТФ-синтазный комплекс ХП принадлежит к семейству АТФаз Fj типа, которые характерны также для бактерий и митохондрий. Комплекс продуцирует АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Скорость синтеза АТФ-синтазой молекул АТФ равна 100-300 с-1 (в зависимости от источника происхождения фер-

Строение АТФ-синтазы

Рис. 2.11. Строение АТФ-синтазы

мента). Для этого используется энергия трансмембранного протонного градиента, генерируемого при движении электронов по цепи электронного транспорта за счет фотохимической трансформации световой энергии. АТФ-синтазный комплекс состоит из двух частей [196]: погруженного в мембрану протонного канала CF0 и энзиматического центра CFP выступающего над поверхностью мембраны в сторону стромы (рис. 2.11). Встроенный в мембрану комплекс CF0 отвечает за перенос протонов через мембрану, внемембранный комплекс CFj выполняет каталитические функции по синтезу/гидролизу АТФ.

CFj состоит из пяти субъединиц (а, 0, у, 5, в), которые являются поверхностными белками и прикрепляются к мембране со стороны стромы. Их стехиометрия 3:3:1:1:1. CF0 включает четыре субъединицы, suI-IV, в предполагаемой стехиометрии 1:1:9-12:1. Характеристики субъединиц комплекса приведены в табл. 2.5.

Представления о структурной организации субъединиц АТФ-синтазного комплекса в мембране были сформированы благодаря успешному применению методов ядерного магнитного резонанса и рентгеноструктурного анализа. Активный фермент представлен в мембране в виде комплекса статических частей и подвижных, вращающихся как для трансмембранных, так и поверхностных субъединиц. Статическая часть состоит из субъединиц I, II, IV CF0 и а, р, 5 CF? К подвижной части относятся субъединицы CFj у и 8, а также 9-12 копий субъединицы III CF0.

Кристалл CFj состоит из перемежающихся а- и р-субъединиц (по три каждого вида), расположенных, подобно долькам апельсина, вокруг асимметричной у-субъединицы. В соответствии 54

Таблица 2.5. Полипептиды АТФ-синтазпого комплекса [196]

Субъединица

Количество TM а-спиралей

Молекулярная масса, кДа

Ген (GW)

Стехиометрия

Функции

CF, а

s

55

atpA (С)

3

Статическая часть (stator), связывание нуклеотида (регуляторное)

CF,p

s

54

atpB (С)

3

Статическая часть (stator), связывание нуклеотида (каталитическое)

CF] ?

s

15

atpE (С)

1

Вращающаяся часть (rotor), регуляция

СТ() I

TM (1)

21

atpF (С)

1

Статическая часть (stator)

CF0 111

TM (2)

8

at pH (C)

9-12

Вращающаяся часть (rotor), транслокация протонов

CF0IV

TM (4)

25

at pl (C)

1

Статическая часть (stator), транслокация протонов

CF! v

S

35

AtpC (C)

1

Вращающаяся часть (rotor), передача энергии

CF( 5

S

21

AtpD (C)

1

Статическая часть (stator), механическая функция, запасание энергии

CF0II

TM(1)

16

AtpG (N)

1

Статическая часть (stator)

Примечание. ТМ и S соответствуют трансмембранному расположению протеина и поверхностному со стороны стромы. Молекулярная масса приведена на основании аминокислотной последовательности зрелого белка, может отличаться от электрофоретических данных. С и N- кодирование хлоропластным и ядерным геномами соответственно.

с принятой моделью синтеза АТФ (называемой также моделью непостоянного катализа), градиент электрического поля, направленный поперек внутренней мембраны и обусловленный элект-рон-транспортной цепочкой, заставляет протоны проходить сквозь мембрану через АТФ-синтазный компонент CF0. Часть этого компонента (кольцо из с-субъединиц) вращается, когда протоны проходят через мембрану. Это с-кольцо жестко связано с асимметричной центральной ножкой (состоящей в основном из у-субъ-единицы), которая, в свою очередь, вращается внутри а3р3-участка компонента CF? Это приводит к тому, что три участка катализа, связывающиеся с нуклеотидами, претерпевают изменения в конфигурации, что приводит к синтезу АТФ.

Основные субъединицы (а3р3) компонента CFj соединены дополнительной боковой ножкой с неподвижным участком CF0, что предотвращает их вращение вместе с у-субъединицей. Структура неповрежденной АТФ-синтазы выявлена при помощи электронной криомикроскопии (ЭКМ). Показано, что боковая ножка - это похожая на канат гибкая перемычка, которая наматывается на комплекс во время его работы.

В определенных условиях каталитическая реакция может протекать в обратном направлении, при этом гидролиз АТФ вызывает прокачку протонов через мембрану. За счет энергии, выделяющейся при гидролизе АТФ, происходит вращение ротора (субъединицы у и с-кольца) и перекачка ионов водорода из области с низким протонным потенциалом в область с высоким протонным потенциалом.

Особенностью организации ФСА является то, что основные надмолекулярные комплексы локализуются в различных участках мембранной системы (рис. 2.12). В гранальных тилакоидах находятся ПБК ФС 2 и основная масса ССК 2, тогда как ПБК ФС 1 локализован в стромальных мембранах и концевых участках гран. Cyt b6/f комплекс распределен равномерно во всех участках мембранной системы ХП. АТФ-синтазный комплекс локализован, как и ФС 1, в стромальных мембранах [223].

Объяснение причин столь специфического, неоднородного распределения ПБК и других белков в мембранной системе ХП изложено в электростатической теории Барбера (цит. по [196]), которая является обобщением большой серии весьма обстоятельных экспериментов. Эта гетерогенность обусловлена особенностями распределения зарядов на поверхности различных 56

Модель строения хлоропласта (вверху) и расположение электрои-транспортиых и АТФ-синтазных комплексов в тилакоидной мембране (внизу) [224]

Рис. 2.12. Модель строения хлоропласта (вверху) и расположение электрои-транспортиых и АТФ-синтазных комплексов в тилакоидной мембране (внизу) [224]: А - тилакоиды гран; В - межгранальные тилакоиды; а - радиус тилакоидов граны; б — радиус межгранальных тилакоидов

ПБК и возможностями их экранирования с помощью катионов среды, а также взаимодействием различных комплексов. Подобное пространственное разделение разных комплексов обусловливает присутствие подвижных переносчиков, транспортирующих восстановленные эквиваленты от одного комплекса к другому, роль которых выполняют молекулы пластохинона и пластоцианина.

In vivo транспорт электронов сопряжен с фотофосфорилири-рованием (ФФ). Согласно хемиосмотической гипотезе Митчела, при транспорте электрона через серию переносчиков на мембране устанавливается электрохимический протонный градиент, так как протоны поглощаются из стромы и высвобождаются только во внутритилакоидное пространство. В результате люмен подкисляется, а строма подщелачивается. Предполагается, что при нециклическом транспорте электронов существуют два участка, на которых создается трансмембранная разность электрохимического потенциала ионов водорода: при расщеплении воды внутри тилакоидного компартмента и при окислении-восстановлении пластохинона - пластохинола (рис. 2.13).

цитозоль

Схема линейного транспорта электронов в тилакоидных мембранах и основных реакций цикла Кальвина

Рис. 2.13. Схема линейного транспорта электронов в тилакоидных мембранах и основных реакций цикла Кальвина

Энергия, запасенная в форме электрохимического потенциала, используется для фосфорилирования АДФ АТФ-синтазой.

ФФ может быть сопряжено со следующими процессами:

нециклическим транспортом электронов - энергия последовательных фотоактов двух ФС используется на окисление Н2О, восстановление НАДФ- до НАДФН и синтез АТФ из АДФ (см. рис. 2.3);

псевдоциклическим транспортом электронов - электроны, донором которых служит вода, проходят по ЭТЦ, но вместо НАДФ+ восстанавливают О9 с образованием воды; при этом выделения кислорода не происходит, поскольку выделение О2 замаскировано эквимолярным его поглощением;

циклическим транспортом электронов - в этом случае функционирует только ФС 1 и электроны от Фд поступают на комплекс Cyt b6/f с использованием пула пластохинонов, затем электроны через Cyt/ и пластоцианин возвращаются на основной энергетический уровень в Р700, а протоны поступают в полость тилакоида (см. рис. 2.3).

Таким образом, фотохимическая стадия фотосинтеза завершается генерацией макроэргов и восстановительной силы (АТФ + НАДФН), необходимых для осуществления процесса ассимиляции углерода.

Путь биосинтеза всех углеродсодержащих органических соединений из двуокиси углерода известен под названием цикла Кальвина или цикла Бенсона-Кальвина (рис. 2.13). Этот цикл происходит в строме ХП и включает в себя четыре основных этапа [225].

Ключевым ферментом цикла Кальвина является РБФК/О. Реакция, катализируемая РБФК, сводится к одновременному присоединению СО2 и воды к РБФ и внутримолекулярному окислению - восстановлению (дисмутации). В результате реакции образуется две молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (ФГК) [225]. Кислород способен конкурировать с СО2, а карбоксилаза может функционировать в качестве оксигеназы. В этом случае образуется одна молекула ФГК, а оставшийся С2-фрагмент участвует в образовании 2-фосфогликолевой кислоты. Реакция, катализируемая РБФО, лежит в основе фотодыхательного цикла. Поскольку СО2 и О2 конкурируют за один и тот же центр связывания на молекуле фермента, скорости этих двух реакций определяются концентрациями обоих газов, а также pH среды, температурой и др. [226].

Так же как и другие процессы метаболизма, ассимиляция углерода при фотосинтезе подвержена регуляции, в основе которой лежит катализ (изменение ферментативной активности), действие масс (влияние концентрации метаболитов и т. п.) и транспорт (передвижение метаболитов между хлоропластом и его клеточным окружением) [225]. Как правило, регулируемыми являются те ферменты, которые катализируют «необратимые» реакции (т. е. реакции с большой величиной отношения между скоростями прямой и обратной реакций, например рибулозо-5-фосфат—>РБФ—>ФГК и фруктозо-1,6-бисфосфат—>фруктозо-6-фосфат).

Последовательность превращений ФГК—>1,3-дифосфоглице-риновая кислота—>триозофосфат в большой степени зависит от действия масс, и на ее первую стадию сильное влияние оказывают концентрации АДФ, АТФ и ФГК.

Транспорт триозофосфатов через мембраны ХП определяется доступностью ортофосфата, от чего в первую очередь и зависит, какая часть продукта фотосинтеза подвергнется дальнейшему метаболизму внутри хлоропласта, а какая сохранится в нем (в виде крахмала) или будет транспортирована из ХП в окружающую клеточную среду [225].

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >