Влияние ионов металлов на устойчивость суспензий дрожжевых клеток

Лиофильные дисперсные системы характеризуются высоким сродством частиц дисперсной фазы к дисперсионной среде. Термодинамическая устойчивость этих систем описывается неравенством:

AF = AU - TAS < 0

Это возможно, когда значения удельной межфазной свободной энергии о не превышают о_кр = ПУ⁸ Дж/см². Клетки микроорганиз мов, для которых поверхностное натяжение на границе с водой приближается к нулю, относятся к типичным лиофильным системам с высокой устойчивостью. Значения поверхностного натяжения некоторых клеток приведены в таблице 12 [9].

Таблица 12 Поверхностное натяжение различных клеток [9]

Хотя современная теория устойчивости дисперсных систем Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека рассматривает устойчивость лиофобных систем, ее математический аппарат может быть использован и для описания устойчивости суспензий клеток микроорганизмов.

С другой стороны, существует точка зрения, что лиофильными золями следует считать такие системы, которые сохраняют свою устойчивость даже в довольно концентрированных растворах солей. Коагуляция таких систем наступает при высоком содержании электролитов в растворе, а коагулирующее действие электролитов, в свою очередь, не зависит от величины и знака заряда противоионов [101]. В этой связи определенный интерес представляло выяснение вопроса о влиянии заряда коагулирующего иона на устойчивость суспензий клеток микроорганизмов.

В исследованиях использовали дрожжевые клетки Torulopsis kefir var kumis и Sacharomyces cerevisiae, поверхность которых состоит преимущественно из фосфатных групп, усиливающих лиофильность системы. О коагуляции судили по изменению оптической плотности суспензий.

При введении солей: NaCl, Pb(NO₃)₂, CuSO₄, СоС1₂, А1С1₃ и FeCl оптическая плотность суспензий клеток Torulopsis kefir var kumis и Sacharomyces cerevisiae остается неизменной в широком интервале концентраций электролитов и лишь в области 10’МО¹

моль/л начинается повышение мутности системы (рис. 20, 21). Поэтому для определения порогов коагуляции использовали зависимость dA/dr от концентрации электролита (рис. 22, 23).

7. NaCI; 2. Pb(N()f; 3. CuSO₄; 4. CoCl₂; 5. AlCly 6. FeCl_}

Рис. 20. Зависимость оптической плотности суспензии клеток Torulopsis kefir var kumis, T - 17 от концентрации электролитов

/. NaCI; 2. Pb(N()f; 3. CuSO₄; 4. CoCl₂; 5. AlCl_}; 6. FeCl_}

Рис. 21. Зависимость оптической плотности суспензии клеток штамма - Saccharomyces cerevisiae, Р - 12 от концентрации электролитов

(dA/drX-u 10⁵

1. NaCl; 2. Pb(NO)₂; 3. CuSO₄; 4. CoCl₂; 5. AlCl_}; 6. FeCl_}

Рис. 22. Дифференциальные кривые изменения оптической плотности суспензий дрожжевых клеток Torulopsis kefir var kumis, T - 17 в присутствии электролитов

/. NaCl; 2. Pb(NOfi₂; 3. CuSO₄; 4. CoCl₂; 5. AlCl_}; 6. FeCl_}

Рис. 23. Дифференциальные кривые изменения оптической плотности суспензий дрожжевых клеток Sacharomyces cerevisiae, Р - 12 в присутствии электролитов

Пороговые концентрации для ионов Na⁺ зафиксированы при ГНУ¹ моль/л, для двухвалентных Со²⁺, Pb²⁺, Cu²⁺ C_k=l 10’² моль/л, а для трехвалентных Fe³⁺ и А1³⁺ минимальная коагулирующая концентрация составляет 1 10³ моль/л. Попытка объяснения коагупирующего действия катионов на основе правила Шульце-Гарди обнаруживает некоторое отклонение от него: действительно, увеличение заряда коагулирующего иона вызывает снижение пороговой концентрации электролита, однако уменьшение расхода электролита с ростом валентности противоиона не соответствует закону «шестой степени».

В работах Ефремова, Усьярова и др. [102] было показано, что агрегация электролитами частиц крупных размеров - порядка сотен и тысяч нанометров - описывается законом:

С . z²’⁵'³’⁵ = const nk

Размеры дрожжевых клеток: 2-5 мкм для Torulopsis kefir var kumis и 3-10 мкм для Sacharomyces cerevisiae находятся в этих пределах. Приложение данного равенства к исследуемым объектам обнаруживает неплохое соответствие: соотношение порогов коагуляции для одно-, двух- и трехзарядных ионов составляет 1:5:33, а найденные на его основе показатели степени z для двухвалентных металлов равны 2,35, для трехвалентных - 3,10.

Что же касается влияния лиотропности ионов на их коагулирующее действие, то рассматриваемые нами коагулянты по радиусам ионов и способности к гидратации располагаются таким образом [103]:

Pb²⁺ > Cu²⁺ > Со²⁺ > Fe³⁺ > Al³⁺ >Na⁺

Т.е. полученные нами результаты по коагулирующему действию ионов указывают на определяющую роль зарядов, а влияние лиотропности, по-видимому можно рассматривать только в ряду ионов с одинаковой валентностью. К сожалению, использовать для этой цели данные по изменению оптической плотности под влиянием электролитов невозможно, поскольку на этот показатель определенное влияние оказывает окраска солей. Более достоверными являются значения ^-потенциала. По влиянию на электрокинетический потенциал дрожжевых клеток двухзарядные ионы можно расположить в ряд: Pb²⁺ > Си²⁺ > Со²⁺, что вполне согласуется с их лиотропностью.

Вхождение показателей степени z (в случае двухвалентных металлов - приближение) в интервал 2,5-3,5 может быть свидетельством дальней агрегации с образованием периодических коллоидных структур [104]. При достаточной глубине второго минимума на потенциальной кривой (>5-10 кТ) частицы, независимо от высоты барьера, коагулируют в дальней яме.

Для обоснования применимости данного утверждения к суспензиям дрожжей с использованием традиционных подходов теории ДЛФО, т.е. рассмотрения баланса сил межмолекулярного притяжения и электростатического отталкивания заряженных частиц, получена информация о влиянии электролитов на устойчивость системы. На основании данных о размерах частиц и результатов электрофоретического исследования клеток рассчитаны энергии их притяжения и отталкивания в среде 1-1 валентного электролита.

Энергию ионно-электростатического отталкивания U. клеток рассчитывали по формуле [105]:

U.= 2-7l^,8‘8₀^,(p_d²aln[l+exp(-xh)],

где ? - диэлектрическая постоянная в объеме раствора, принятая для воды 80,1;

• ?₀ - диэлектрическая проницаемость вакуума, 8,85-10“¹²Ф/м;
• (p_d - штерновский потенциал (при расчете заменялись ^-потенциалами) клеток;

а - средний радиус клетки (условно принятой за сферическую частицу), равный приблизительно 4 мкм;

h - расстояние между поверхностями частиц, мкм;

% - дебаевский радиус или величина, обратная толщине диффузного слоя, которая рассчитывалась по формуле [105]:

4-7i-L-e²-w.-z²-

гк-Т

где е - заряд электрона, 1,60-10^-19 Кл;

п. — коагулирующая концентрация электролита;

z. - заряд (валентность) коагулирующего иона к - постоянная Больцмана, 1,38-10^-23 Дж/К;

Т - абсолютная температура.

где А],-константа Гамакера, учитывающая взаимодействие клеток (1) в воде (2), значение которой равнялось 0,12 -10’²⁰ Дж; S=H/a.

1. C_v =1-Ю³ М; 2. С =1-10 ²М; 3. С_х =Т10-' М; 4. =1 М

NaCl ⁷ NaCl ⁷ NaCl ⁷ fitaCl

Рис. 24. Энергия взаимодействия дрожжевых клеток Torulopsis kefir var kutnis в среде 1-1- валентного электролита

Результирующую энергию взаимодействия находили как сумму энергий ионно-электростатического отталкивания и межмолекулярного притяжения (U):

и = и.+и

1 m

Расчеты энергий взаимодействия клеток проводили при различных концентрациях NaCl - 10’³-10’¹ моль/л (рис. 24, таблицы 13-16). Как видно из рисунка 24, агрегация клеток осуществляется на расстояниях дальнего порядка, h»500 А.

Анализ кривых энергии взаимодействия частиц показывает, что клетки дрожжей Torulopsis kefir var kumis довольно устойчивы к воздействию NaCl. При концентрации электролита 10*³ моль/л (таблица 13 ) размытая диффузная часть ДЭС, равная 1,90 • 10’⁷, препятствует сближению частиц. Силы отталкивания меж ду одноименно заряженными частицами обусловливают высокие значения U., для преодоления которых необходима большая кинетическая энергия. Увеличение концентрации NaCl до 10'² моль/л (таблица 26) приводит к некоторому сжатию диффузной части ДЭС и, соответственно, к уменьшению энергии отталкивания частиц. Тем не менее, и при этих условиях значения энергии отталкивания остаются довольно высокими вследствие увеличения плотности энергии ионных атмосфер [104] и система сохраняет свою устойчивость.

Значительное снижение энергии отталкивания клеток наблюдается при увеличении концентрации электролита до 10’¹ моль/л (таблица 15). При этом толщина диффузной части уменьшается до 7,80 • 10’⁸ м, а значения энергии взаимодействия частиц на довольно больших расстояниях h»500 А начинают снижаться на 1-5 порядков, т.е. приближаются к нулю.

И, наконец, концентрация NaCl в 1 моль/л (таблица 16) приводит к такому сжатию диффузной части ДЭС (X = 2,46 10’⁸ м, ае = 2,30 10⁶ м¹), что на расстояниях между частицами h>2500 А потенциальный барьер исчезает и все значения суммарной энергии взаимодействия частиц становятся отрицательными. Однако значение электрокинетического потенциала при этом остается высоким: = -38 мВ.

Такая агрегация - коагуляция во второй потенциальной яме -определяется как сверхдальнодействие [78, 104], при этом частицы не могут ни разойтись, ни приблизиться вплотную друг к другу и продолжают существовать в виде «пары», совершающей совместное броуновское движение, а также колебания вдоль связи [103]. К этой паре могут присоединяться и другие частицы с образованием тройников и более сложных структур. Частицы, связанные на больших расстояниях, т.е. через большие прослойки жидкости, приобретают фазовую устойчивость и s_o. Расчеты Ефремова и Нерпина [103,104] показали, что с увеличением числа частиц в агрегатах глубина второго минимума увеличивается, способствуя протеканию коллективных взаимодействий. При этом во многих случаях образуются периодические коллоидные структуры, квазикристаллические образования, обладающие дальним порядком [1 ;104]. Так как периодичность структур особенно характерна для биологических систем, то не исключена возможность их образования и в случае клеток дрожжей.

Таблица 13

Энергии взаимодействия клеток

Torulopsis kefir var kumis в среде 1* 10’³ М NaCl. ?=-52 мВ, 1=1,901(к⁷м, %=1,28'10⁶ м~'

Таблица 14

Энергии взаимодействия клеток

Torulopsis kefir var kumis в среде 140² М

NaCU=-48 мВ, 2=2,46-10'м, х=4,05-10⁶ м¹

Таблица 15

Энергии взаимодействия клеток

Torulopsis kefir var kurnis в среде 10¹ М

NaCU=-43 мВ, 2=7,80-1 (к⁸м, %=1,28-10⁷ м¹

Таблица 16

Энергии взаимодействия клеток

Torulopsis kefir var kumis в среде 1М

NaCl.t=-38 мВ, л=2,46<К4⁸м, у=4,06-10⁷

Определяющую роль в стабилизации лиофильных коллоидов играют сольватные слои, хотя природа их стабилизирующего действия до конца не выяснена. В случае клеток микроорганизмов в силу их биологической специфичности в приповерхностном слое могут находиться продукты их метаболизма, что также вносит свой вклад в стабилизацию системы.

Стабилизирующую роль сольватных оболочек Ребиндер и Щукин связывают с наличием у них сопротивления сдвигу, мешающего их выдавливанию из зазора между частицами, а также, как указывалось выше, отсутствием заметного поверхностного натяжения на границе сольватированного слоя поверхности со свободной фазой. Устойчивость сольватированных слоев Дерягин объясняет формированием на границе раздела фаз полимоле-кулярных сольватных слоев, свойства которых резко отличаются от свойств объемной фазы [1; 104]. На возникновение сил отталкивания неэлектростатического происхождения при сближении сольватированных частиц неоднократно указывал Глазман. Эти силы определяются как структурная составляющая расклинивающего давления [107].

Отталкивание, которое возникает при сближении одинаково заряженных поверхностей, находящихся в растворе электролита, не явлется кулоновским, так как заряд на поверхности раздела фаз полностью нейтрализован зарядом ионов диффузного слоя. Появление сил отталкивания определяется увеличением плотности энергии ионно-электростатического поля в зоне перекрытия ионных атмосфер. Разность значений энергий, соответствующих неперекрытой и перекрытой зонам двойных электрических слоев, представляет собой электростатическую составляющую расклинивающего давления, расчет которой на основе теории ДЭС Гуи-Чепмена и теории растворов сильных электролитов Де-бая-Гюккеля был впервые выполнен Дерягиным, а затем и другими исследователями. При этом принимали, что ионы - точечные заряды, растворитель - сплошная среда с постоянной диэлектрической проницаемостью, а распределение ионов в наружном ионном слое подчиняется закону Больцмана.

По данным [104] давление тонких пленок жидкостей вблизи лиофильных поверхностей падает до нуля при достижении толщин порядка 200-250 тц. Полагают, что такие пленки образуются вокруг частиц и в лиофобных золях, однако толщина их долж на быть гораздо меньше - порядка десятков молекулярных слоев.

Согласно [108], толщина пленки бензола на поверхности ртути достигает 360 А. Однако имеются и такие данные, что пограничный слой нитробензола на стекле и кварце имеет толщину более 1000 А [109]. Ряд других исследователей также приходит к выводу о существовании толстых граничных слоев [ПО].

Некоторый вклад в устойчивость суспензии дрожжей вносит, очевидно, и наличие на поверхности этих клеток сильно гидратирующихся фосфатных групп. Помимо высокого заряда, сольватирующее, и, соответственно, стабилизирующее действие этих групп может быть обусловлено способностью к образованию водородных связей с молекулами воды. Именно этот фактор и подразумевается под силами отталкивания неэлектростатической природы в работах Дерягина и Глазмана.

Поэтому обнаружение областей коагуляции дрожжевых клеток в растворе 1 М NaCl на сверхдальних расстояниях - при h>2500 А вполне объяснимо. Если вещества органической природы образуют на поверхности минеральных частиц слои толщиной более 1000 А, то для такой высоколиофильной и сильносольвати-рованной системы, как клетки микроорганизмов, существование протяженной гидратной оболочки порядка 10³ А не подлежит сомнению. В пользу этого свидетельствут и такой факт, что «посадочная» площадь адсорбируемых молекул воды, рассчитанная с учетом их дипольного момента, оказалось равной 10 А² [104]. Однако частицы, взаимодействуя через такие прослойки жидкости, не подвергаются осаждению или слипанию, а фиксируются на дальних расстояниях.

Руцков, рассматривая физическую природу лиотропных рядов ионов, подчеркивает, что воздействие ионов различной природы на самые разнообразные свойства коллоидных и истинных растворов заключается именно в воздействии на структуру растворителя [111]. Таким образом, действие лиотропного ряда ионов следует объяснять не с точки зрения воздействия на вещества, составляющие коллоидные частицы, а на окружающую их среду.

Все это свидетельствует об огромной роли сольватированной воды в устойчивости коллоидных систем, в особенности таких высоколиофильных, как суспензии клеток микроорганизмов. Таким образом, низкие значения показателя степени z=2,35-3,1 в выражении nz^x=const и фиксация на дальних расстояниях при воздействии высокой концентрации электролита вполне обоснованны.

Обращает на себя внимание факт коагуляции дрожжевых клеток Torulopsis kefir var kumis при высоких значениях ^-потенциала. Это становится тем более значительно, если учесть, что критическими значениями при коагуляции считаются величины ^=20-25 мВ. Здесь необходимо отметить, что электрокинетичес-кий потенциал является постольку характеристикой границы раздела фаз, поскольку он отражает влияние толщины диффузной части ДЭС на свойства поверхности. А толщина диффузной части ДЭС определяется концентрацией противоиона, т.е. опять речь идет о количестве ионов, которые, отнимая или деструктурируя молекулы воды вблизи поверхности, способствуют их фиксации или коагуляции. Иными словами, причиной коагуляции является не столько снижение сколько понижение расклинивающего давления в результате сжатия ДЭС или водоотнимающего действия ионов. Насколько это действие отличается у ионов различной природы и валентности, можно судить по величине константы скорости коагуляции, рассчитанной по формуле:

эксп

полученной из уравнения [213]:

В • К_т ? С²

где

- изменение оптической плотности раствора во времени;

плотность дисперсной фазы;

В - постоянная, зависящая от свойств дисперсионной среды и дисперсной фазы; т.к. рассматривается одна и та же система, то В принята за 1;

С²- минимальная пороговая концентрация коагуляции, кг/м³.

Как видно из таблицы 17, константа скорости коагуляции при переходе от NaCl к FeCl₃ увеличивается от 1,8 до 1,56 10⁴, т.е. возрастает на 4 порядка. Невысокое значение К_эксп в случае ионов свинца, который проявляет наибольшую коагулирующую способность, можно объяснить, вероятно, тем, что он образует нерастворимое соединение с фосфатными группами поверхности и это отражается на мутности системы. В целом, полученные значения К_эксп вполне согласуются с предположением о дальней агрегации клеток через прослойки жидкости среды.

Таблица 17

Константы скорости коагуляции клеток в присутствии электролитов

При сравнении коагулирующего действия металлов различной природы может возникать вопрос о механизме коагуляции ионами Fe³⁺ и А1³⁺. Поскольку в результате гидролиза этих ионов возможно образование частиц Ме(ОН)₃, стабилизированных МеО⁺-ионами, можно было бы предположить агрегацию клеток в их присутствии по механизму гетерокоагуляции. Однако найденные в экспериментах пороговые концентрации FeCl₃ и А1С1₃ составляют 0,269 г/л и 0,240 г/л соответственно, в то время как для получения их золей используют концентрацию в 2 %, т.е. 20 г/л. Поэтому высокие значения К_эксп в случае коагуляции клеток дрожжей ионами Fe³⁺ и А1³⁺, скорее всего, связаны с влиянием их зарядов.

С другой стороны, если образование таких частиц и имело бы место, они адсорбировались бы на поверхности клеток, т.к. размеры частиц золей и клеток отличаются на 2 порядка.

Таким образом, причиной высокой устойчивости суспензий дрожжевых клеток является наличие на их поверхности многоза рядных фосфатных групп, гидратирующихся с образованием водородных связей с молекулами воды, что обеспечивает снижение поверхностного натяжения на границе клетка/вода. Значительная сольватация поверхности клеток приводит к появлению структурной составляющей расклинивающего давления, которая так же, как и электростатические силы, препятствует сближению частиц. В результате при введении в систему электролитов агрегация частиц начинается при концентрациях солей, намного больших, чем по закону «шестой степени».

Расчеты энергий взаимодействия частиц в среде 1 -1 -валентного электролита NaCl показали, что агрегация частиц идет во второй потенциальной яме, на дальних расстояниях. При этом частицы взаимодействуют через прослойки жидкости с образованием периодических коллоидных структур. Действие электролитов на суспензии дрожжевых клеток заключается как в сжатии диффузной части ДЭС и соответствующем снижении ^-потенциала, так и в дегидратации поверхности клеток.

Вопросы для самоконтроля

• 1. Почему суспензии клеток микроорганизмов относят к лиофильным дисперсным системам?
• 2. Как изменяется закон «шестой степени» при описании устойчивости биодисперсий?
• 3. Какие особенности биодисперсий необходимо учитывать при описании их устойчивости с помощью теории ДЛФО?
• 4. Какова роль сольватных оболочек в устойчивости клеток микроорганизмов к воздействию электролитов?
• 5. Каковы особенности ДЭС на поверхности клеток микроорганизмов?
• 6. Имеются ли минимумы на потенциальных кривых взаимодействия клеток микроорганизмов в среде NaCl?

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРОВ