Методы конструирования гибридных молекул ДНК in vitro

В 1972 г. опубликована работа, в которой П. Берг с сотрудниками впервые описали получение in vitro гибридной молекулы, состоящей из ДНК вируса SV40 и ДНК фага Xdvgal. Гибридные молекулы конструировали методом, получившим название кон-некторного.

Принцип первого варианта этого метода (рис. 7) заключается в том, что к З'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы достраивали олго (dA) - сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента - олиго (dT) - сегменты примерно такой же длины. При смешивании полученных таким образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счет образования водородных связей между олго (dA)- и олиго(бТ)-последовательностями.

Данный метод обычно используют при клонировании ДНК-копий (кДНК) матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах.

Более простой и самый популярный метод получения in vitro гибридных молекул ДНК - рестриктазно-лигазный. Первые гибридные ДНК получены этим методом в 1973 г. (рис. 8).

Суть его заключается в следующем:

  • а) рестриктаза специфически разрезает молекулы ДНК на фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкие концы;
  • б) препараты различных молекул ДНК, гидрализованных одной и той же рестриктазой, смешивают и при определенных условиях липкие концы разных фрагментов ДНК реассоциируют за счет комплементарного взаимодействия;
  • в) с помощью ДНК-лигазы происходит ковалентное объединение ассоциированных фрагментов ДНК.

ДНК 1

Схема коннекторного метода

Рис 7. Схема коннекторного метода

По описанной схеме in vitro могут быть ковалентно соединены два и более любых фрагментов ДНК, полученных при гидролизе одной и той же рестриктазой. Однако с помощью рестрик-таз (по крайне мере, одного фермента) в каждом конкретном случае можно получить лишь специфический, строго определенный набор фрагментов данной ДНК. Но затем получила распространение новая модификация рестриктазно-лигазного метода (смотри рис. 8), позволяющая достаточно просто рекомбинировать in vitro практически любые фрагменты ДНК. Она включает:

  • а) пришивку лигазой фага Т4 «стык в стык» по тупым или по липким концам коротких синтетических двухцепочечных сегментов к обоим концам фрагмента ДНК, который предполагают рекомбинировать;
  • б) обработку определенной рестриктазой пришитых олиго-нуклеотидных дуплексов, содержащих места действия этого фермента, в результате чего образуются липкие концы;

в) рекомбинацию in vitro полученного фермента с выбранными молекулами ДНК по обычной схеме рестриктазно-лигазного метода.

Схема рестриктазно-лигазного метода

Рис. 8. Схема рестриктазно-лигазного метода

Синтетические сегменты ДНК, содержащие в своем составе последовательности, узнаваемые рестриктазами, получили название линкерных молекул. Использование линкерных молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации фрагментов ДНК in vitro универсальным, поскольку исходные фрагменты ДНК можно получать самыми разными методами.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >