МЕТОДИКА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Лабораторно-аналитические исследования выполнены с использованием общепринятых в почвоведении, экологии и биологии методов (Галстян, 1978; Хазиев, 1990; Практикум..., 1989; Казеев, Колесников, 2012).

Изучена активность ферментов двух классов: оксидоредуктаз (каталаза, дегидрогеназа (ДГ), пероксидаза (ПО) и полифенолоксидаза (ПФО)) и гидролаз ф-фруктофуранозидаза, или инвертаза и фосфатаза). Активность каталазы и дегидрогеназы определяли по А.Ш. Галстяну (1978), инвертазы - по А.Ш. Галстяну с фотоколориметрическим окончанием по Ф.Х. Хазиеву (1990). Активность пероксидазы и полифенолоксидазы - по методике Л.А. Карягиной и Н.А. Михайловой (1986). Активность фосфатазы - методом А.Ш. Галстяна и Э.А. Арутюняна (1966). Содержание органического вещества - общий гумус определяли по методу И.В. Тюрина в модификации Никитина (1992).

Определение активности ферментов основано на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, pH среды, концентрации субстратов, величины навески почвы, времени инкубации. Для количественного определения конечных продуктов реакции применяются различные химические, фотометрические, колориметрические и др. методы. Для качественных измерений наличия ферментов в почве широко используются хроматографические методы (Хазиев, 2005).

Сущность методов определения активности ферментов почвы заключается в следующем: навеску почвы насыщают ингибитором микроорганизмов (обычно толуолом), добавляют буферный раствор с pH, оптимальным для данного фермента, и определенное количество субстрата. Реакционную смесь чаще всего выдерживают в термостате (температура 30-37°С) в течение определенного времени при периодическом перемешивании и после этого проводят количественный учет или качественную идентификацию продуктов реакции. Активность фермента выражают в количествах переработанного субстрата или образующегося продукта реакции в течение определенного промежутка времени и рассчитывают на единицу веса почвы (Хазиев, 2005).

Обязательно необходим анализ контрольных образцов (образцы, стерилизованные в течение 3 часов в сушильном шкафу при 180°С) для установления каталитической активности почвы и контроль для определения чистоты реактивов (Казеев, Колесников, 2012).

Каталаза (Н2О2: Н2О2 - оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6.)

Каталаза катализирует реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и молекулярного кислорода:

Н2О2 + Н2О2 -> О2 + 2Н2О

Перекись водорода образуется в процессе дыхания живых организмов и в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ. Токсичность перекиси водорода определяется его высокой реакционной способностью, которую проявляет синглетный кислород *О2. Его высокая реакционная способность приводит к неконтролируемым реакциям окисления. Роль каталазы заключается в том, что она разрушает ядовитую для организмов перекись водорода (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

Каталаза широко распространена в клетках живых организмов, в том числе микроорганизмов и растений. Высокую каталазную активность проявляют также почвы.

Методы определения каталазной активности почвы основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии ее с почвой по объему выделяющегося кислорода (газометрические методы) или по количеству доступной перекиси, которое определяют перганатометриче-ским титрованием или колориметрическим методом с образованием окрашенных комплексов (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

Исследованиями Е.В. Даденко с соавторами (2009) установлено, что при хранении образцов активность каталазы из всех ферментов снижается в наибольшей степени, поэтому ее определение необходимо проводить в первую неделю после отбора образцов.

Пероксидазы (донор : Н2О2 - оксидоредуктаза. КФ 1.11.1.7.)

Пероксидазы осуществляют окисление органических веществ почв (фенолов, аминов, некоторых гетероциклических соединений) за счет ки слорода перекиси водорода и других органических перекисей, образующихся в почве в результате жизнедеятельности микроорганизмов и действия некоторых оксидаз (например, уратоксидазы). Эти ферменты играют важную роль в процессе образования гумуса (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

При определении пероксидазной активности почвы в качестве акцепторов кислорода используют полифенолы: пирогаллол, пирокатехин и др. Под действием кислорода перекиси при участии пероксидазы полифенолы окисляются и переходят в хиноны (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

Методы определения пероксидазной активности почвы основаны на учете количества продуктов окисления полифенолов, используемых в качестве субстратов фермента, путем фотометрических измерений интенсивности их окраски в случае образования окрашенных соединений (например, пурпургаллина) или методом титрования (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

Полифенолоксидазы (О-дифенол: кислород-оксидоредуктаза. КФ

1.10.3.1.)

Полифенолоксидазы участвуют в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Они катализируют окисление фенолов (моно-, ди-, три-) до хинонов в присутствии кислорода воздуха. Хиноны в соответствующих условиях при конденсации с аминокислотами и пептидами образуют первичные молекулы гуминовой кислоты (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

Методы определения полифенолоксидазной активности почвы основаны на измерении скорости окисления внесенных в почву полифенолов. Наиболее активно окисляется пирогаллол (Купревич, Щербакова, 1966).

Дегидрогеназы (субстрат: НАД (Ф) - оксидоредуктазы, КФ 1.1.1).

Дегидрогеназы катализируют реакции отщепления водорода, т.е. дегидрирования органических веществ, и выполняют роль промежуточных переносчиков водорода. В почве субстратом дегидрирования могут быть неспецифические органические соединения (углеводы, аминокислоты, спирты, жиры, фенолы и т.д.) и специфические (гумусовые вещества). Дегидрогеназы в окислительно-восстановительных реакциях функционируют как переносчики водорода и разделяются на две группы: 1) аэробные, которые передают мобилизированный водород кислороду воздуха; 2) анаэробные, которые передают водород другим акцепторам, ферментам (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

Для определения активности дегидрогеназ почвы в качестве водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый — ТТХ), которые акцептируя мобилизованный дегидрогеназой водород, восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилфор-мазан — ТФФ) (Хазиев, 2005; Казеев, Колесников, 2012).

Инвертаза (0 - фруктофуранозидаза, сахараза, КФ 3.2.1.26)

Инвертаза является карбогидразой, она действует на 0 - фруктофура-нозидазную связь в сахарозе, раффинозе, генцианозе и др. Наиболее активно этот фермент гидролизует сахарозу с образованием редуцирующих сахаров — глюкозы и фруктозы (Казеев, Колесников, 2012).

Инвертаза широко распространена в природе и встречается почти во всех типах почв. Очень высокая активность инвертазы обнаружена в горнолуговых почвах. Активность инвертазы четко коррелирует с содержанием гумуса и почвенным плодородием. Рекомендуется при исследовании влияния удобрений для определения их эффективности. Методы определения активности инвертазы почв основаны на количественном учете редуцирующих гексоз (глюкозы и фруктозы), образующихся при гидролизе сахарозы и по изменению оптических свойств раствора сахарозы до и после воздействия фермента. Первый способ может быть применен при изучении фермента с очень широкой амплитудой активности и концентрации субстрата. Поляриметрический и фотоколориметрический способы более требовательны к концентрации сахаров и неприемлемы для почв с высоким содержанием органического вещества, где получаются окрашенные растворы; поэтому эти методы ограниченно применяются в почвенных исследованиях (Казеев, Колесников, 2012).

Фосфатаза (фосфогидролазы моноэфиров ортофосфорной кислоты. КФ 3.1.3.1-2)

При определении фосфатазной активности в качестве субстрата используют различные моноэфиры фосфорной кислоты. Наиболее широко применяют водорастворимые соли фенолфталеинфосфата, фенилфосфата, глицерофосфата, а- или 0-нафтилфосфата и п-нитрофенилфосфата. При их ферментативном гидролизе выделяются минеральный фосфор и органический радикал субстрата.

Методы определения фосфатазной активности почвы основаны на количественном учете неорганического фосфора (молибденовокислым аммонием или др.) или спиртовой части гидролизованного субстрата.

Почвенные свойства широко изменчивы как во времени, так и в пространстве. Сложная организация почв требует интеграции многих видов данных по широкому диапазону пространственных и временных масштабов. Поэтому осуществление отбора почвенных проб должно, быть тщательно спланировано. Рационально организованный отбор образцов позволяет дать более точную и надежную оценку почвенных свойств и показателей и, следовательно, ее состояния.

Отбор образцов включает метод отбора, размер образца, глубину отбора, повторность, сроки отбора. Кроме этого важно найти компромисс между информационной ценностью отобранного материала и стоимостью процесса пробоотбора, пробоподготовки и количества анализируемого материала. Данные должны быть собраны таким образом, чтобы исследуемый показатель состояния почвы отражал реальную обстановку и был сопоставим в различных почвах (Dick, Thomas, 1996).

Образцы почв должны наиболее полно характеризовать исследуемую площадь, как по почвенному покрову, так и по осуществляемым мероприятиям и влиянию естественных факторов: растительности, рельефа и др. (Хазиев, 2005).

В связи со значительной вариабельностью биологических признаков необходимо соблюдать достаточную повторность почвенных проб. С пробной площади можно брать 3-5 индивидуальных образцов и анализировать их отдельно. В этом случае получаются данные о пространственном варьировании свойств почвы. Для получения представления о среднем значении исследуемых показателей следует анализировать тщательно отобранный средний почвенный образец, который составляется смешиванием 3-7 индивидуальных проб массой по 100-200 г (Казеев, Колесников, 2012).

Лучший способ получить наиболее полную и достоверную информацию о почвенных параметрах в условиях их временного варьирования -многократное изучение в различные периоды года и усреднение данных. При однократном изучении время отбора образцов не должно совпадать или следовать сразу же за периодами заморозков или засухи (Methods in Applied..., 1995). Многолетние мониторинговые исследования необходимо осуществлять в одно и то же время.

Значения ферментативной активности в отдельные сроки, а также динамика изменений в течение сезона зависит от типа угодий, срока наблюдений и вида показателя (Даденко, 2010; Даденко и др., 2013). Сезонные изменения ферментативной активности пахотного горизонта менее значительны, чем дернового. Это связано с ежегодным перемешиванием поверхностного горизонта при обработке почвы, выравненностью условий, большей однородностью распределения возделываемых культур по сравнению с естественной степной растительностью (Даденко, 2010; Даденко, Мясникова и др., 2013).

Наименьшее варьирование отмечено в весенние и осенние месяцы, в то время как максимальные различия отмечены в июле-августе. При мониторинге почв исследования необходимо проводить в одно и то же время. Для черноземов Ростовской области таковыми являются май-июнь или сентябрь - периоды наименьшего варьирования ферментативной активности (Даденко, 2010; Даденко и др., 2013).

При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного горизонта, при изучении свойств всего почвенного профиля — по генетическим горизонтам (снизу вверх). Разрез должен быть вырыт непосредственно перед взятием образцов. Использование старых открытых разрезов или разрезов, периодически откапываемых и закапываемых допустимо только при условии зачистки лицевой стенки разреза не менее чем на 50 см. Образцы берут по всей толще горизонта, что особенно необходимо для последующего пересчета результатов на столбик почвы с площадью поверхности 1 см2. Для черноземов с их мощными гумусовыми горизонтами и посте пенными переходами между ними образцы отбирают десятисантиметровым слоем как это общепринято в почвоведении из середины горизонта. При специальных исследованиях или при сложности дифференциации почвы на генетические горизонты иногда применяют отбор проб сплошной колонкой через каждые 10 см (Казеев, Колесников, 2012).

Биологические параметры почвы рекомендуется анализировать в свежих образцах как можно быстрее после отбора проб (ISO 10381-6:2009). Однако, это не всегда возможно, так как количества образцов, анализируемых параметров и аналитических процедур, необходимых для репрезентативных данных превышает возможности незамедлительного анализа. Особенно это актуально при проведении массовых исследований, когда образцы отбираются в различных местах в большом количестве. Кроме этого может возникнуть необходимость в повторном проведении анализов с целью подтверждения ранее полученных данных. В этом случае единственная возможность - хранение образцов с использованием метода минимально изменяющего биологический статус, с целью исключения ошибок интерпретации результатов. Поэтому важным является вопрос хранения почвенных образцов, и в первую очередь, способ хранения.

Наиболее часто рекомендуемые условия хранения, особенно для проведения определения биологических показателей почв, при 2-4°С, допускается и хранение при отрицательных температурах (-4; -20 и даже ниже, в зависимости от целей исследования) (Ross, 1970; Pancholy, Rice, 1972; Ross et al., 1980; Dick et al., 1996, Хазиев, 2005; Microbiological Methods.., 2006; Lorenz et al., 2006; ISO 10381-6:2009).

Показано, что некоторые биологические свойства (микробная биомасса, дыхание, ферментативная активность) стабильны на начальных сроках хранения. При этом авторы указывают различные допустимые сроки хранения: 7 дней, 28 дней, 3 месяца, несколько лет (Ross, 1970; Pancholy, Rice, 1972; Галстян, 1974, 1978; Звягинцев, 1976; Ross et al.,1980; Dick et al,1996, Stenberg et al., 1998; Хазиев, 2005; Lorenz et al., 2006; Microbiological Methods...., 2006; ISO 10381-6:2009 и др.).

Наши исследования различных способов хранения почвенных образцов не выявили оптимального способа (Даденко и др., 2009). Минимум изменений ферментативной активности приходится на воздушно-сухие образцы и на естественно-влажные образцы, хранимые в условиях низких положительных температур (холодильник).

Образцы почвы для исследования отбирались из пахотных горизонтов на глубину вспахивания (20 - 30 см). На целинных или залежных участках образцы отбирали не только из верхних горизонтов почв, а из всего гумусового профиля (А+АВ). В отдельные сроки были заложены полнопрофильные разрезы. Во всех случаях в верхних горизонтах дополнительно отбирались почвенные образцы из прикопок.

Сроки отбора образцов на изучаемых участках совпадали и выбирались, согласно рекомендациям, изложенным выше.

Почвенные образцы высушивались при комнатной температуре, при необходимости они подвергались хранению в условиях низких положительных температур (холодильник). Определение активности ферментов проводили с одинаковой навеской (1 г) свежей воздушно-сухой, очищенной от растительных остатков и камней, почвы, просеянной через сито диаметром отверстий 1 мм, при постоянной температуре 30°С (кроме каталазы — 20°С, активность которой определяется газометрически).

Показатели ферментативной активности почв характеризуются значительным варьированием. Динамичность их связывают с зависимостью от сочетания температуры и влажности, наличием доступных источников питательных веществ и жизнедеятельностью микроорганизмов (Зайцева, Звягинцев, 1979; Ross, 1987; Patra et al., 1990). Высокая степень варьирования активности почвенных ферментов требует обязательного проведения статистического анализа.

Статистическая обработка результатов исследования осуществлена с использованием статистического пакета Statistica 10.0. Проведен расчет следующих основных показателей вариационной статистики: среднее ± среднего (М± гл), стандартное отклонение (s), коэффициент вариации (CV) (Дмитриев, 2010). При обработке результатов исследования использовали как дисперсионный, так и корреляционный анализы. Чувствительность исследуемых показателей оценивали по степени их снижения в ответ на антропогенное воздействие - распашку.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >