Влияние антибиотков на биохимические свойства чернозема

Изменение и динамика восстановления биохимических свойств чернозема в условиях острого загрязнения

Изменение ферментативной активности чернозема

Активность почвенных ферментов является хорошим диагностическим показателем плодородия почв и его изменения при различных антропогенных нагрузках (Абрамян, 1992; Галстян,1974, 1978, 1982; Звягинцев 1978; Хазиев, 1976; Казеев и др., 2004; Даденко и др., 2014). Применению ферментативной активности как диагностического показателя загрязнения почв способствуют низкая ошибка опытов и устойчивость ферментов к температурам, высушиванию, длительному хранению, протеолизу, облучению и т.п. (Звягинцев и др., 1976; Звягинцев, 1978; Даденко и др., 2014). При оценке влияния разнообразных видов загрязнения на состояние и функционирование почв показана ведущая роль ферментативной активности (Колесников и др., 2006, 2011, 2013; Казеев и др., 2010; Денисова и др., 2011).

Загрязнение чернозема антибиотиками приводит к снижению активности исследованных ферментов. Полученные результаты представлены в таблицах 8-12. С увеличением концентрации антибиотиков эффект ингибирующего действия усиливается. Смесь фармазин-нистатин на 10-е сут. опыта вызывала наибольшее подавление активности каталазы (р<0,001). На дальнейших сроках исследования наблюдалось восстановление активности каталазы, дегидрогеназы и инвертазы до контрольных значений, за исключением активности фосфатазы. Аналогично полученным результатам, в других исследованиях, было показано, что антибиотики тетрациклинового ряда ингибируют активность почвенных ферментов (каталазы и фосфатазы) на 35-55% в концентрации 300 мг/кг, по сравнению с контролем (Feng et al., 2009). Максимальное снижение активности всех исследуемых ферментов установлено на 10 сут. опыта, на дальнейших сроках, наблюдается тенденция к восстановлению их активности. Комплексы антибиотиков оказали наиболее выраженный эффект воздействия на почвенные ферменты. Например, смесь фармазин+нистатин, приводит к снижению активности каталазы, дегидрогеназы и фосфатазы более чем на 50 % (р<0,001) на 10 сутки опыта.

Ветеринарный антибиотик фармазин и его смесь с нистатином, оказала наиболее выраженное ингибирующее воздействие на активность дегидрогеназы, нежели бензилпенициллин и его смесь с нистатином. Ранее, в работах Feng и др. (2009), было показано, что антибиотики из группы тетрациклинов значительно снижают активность фосфатазы (концентрации до 1000 мг/кг почвы) нежели дегидрогеназы. Активность фосфатазы оказалась наименьшей на 10-е сутки, затем немного повысилась на 60-е сутки и снова значительно снизилась на 120-е сутки. В вариантах опыта с антибактериальными препаратами (фармазин, бензилпенициллин) наблюдается наименьшая активность инвертазы на 10-е сут. и затем ее активность возрастает и максимальна на 120-е сут. эксперимента. В вариантах же с сочетаниями препаратов на 60-е сутки активность инвертазы оказалась ниже, чем на 10-е сут., но затем ее активность увеличивается (Акименко, 2013).

При исследовании влияния антибиотиков (ампициллина, стрептомицина, тилозина) в концентрации 500 мг/кг установили, что активность каталазы снижалась на 10-15% при внесении антибиотиков и на 20-30% (например, смеси стрептомицина и тилозина с инпутом) при внесении их смесей (табл.9). На 30-е сут. инкубации наблюдается тенденция восстановления активности фермента. Из антибиотиков наиболее эффективным в отношении дегидрогеназы (табл. 10) оказался тилозин, из смесей препаратов ампициллин+инпут.

Таблица 8

Влияние антибиотиков в концентрации 100 и 600 мг/кг на ферментативную активность чернозема обыкновенного

Сутки

Контроль

Бензилпенициллин

Бензилпенициллин + нистатин

Фармазин

Фармазин + нистатин

Активность каталазы (мл СЬ/г/мии)

10

16,43+0,03

11,17+0,04**710,27+0,05**

11,97+0.04* */10,73+0,14**

12,10+0,04*/! 1,73+0,04*

8,80+0,08***75,77+0,08***

60

12,26+0,08

11,42+0,03/11,13+0,01

11,97+0,04/10,73+0,14

11,30+0,05/10,85+0,01

10,47+0,09*/10,16+0,02*

120

11,59+0,13

10,00+0,01 */9,20+0.05*

10,67+0,04/9.83+0,04

10,23+0,06**78,50+0,05**

9,77+0,04*/9,07+0,11*

Активность дегидрогеназы (мг ТФФ/г/24ч)

10

31,34+0,32

22,60+0,69**/19,30+0,59***

21,50+0.48**717,38+0.06***

24,00+0,47* */16,47+0,19***

21,90+0,85**79,65+0,33***

60

33,65+0,27

32,30+0,08/29,42+0,26

29,00+0,55*724,58+0,22**

31,50+0,15/28,66+0,13

27,40+0,30*723,56+0,26**

120

26,30+0,02

22,68+0,01 */21,90+0,01*

24.93+0.01/24,11+0,02

22,19+0.01*721,37+0,01*

24,50+,01/24,29+0,02

Активность фосфатазы (мг Р2О5/10г/24ч)

10

3,60+0,01

1,97+0,01 * * */1,07+0,01 * * *

2,29+0,01 **/1,4+0,01***

2,50+0.01 **/1,14+0,01***

2,76+0,01 */1,90+0,01***

60

3,11+0,02

2,83+0,01/1,68+0,02***

2,90+0,02/1,82+0,02***

2.69+0,03*/1,68+0,02* * *

2,76+0,01 */1,90+0,02***

120

3,14+0,01

2,15+0,02* */1,54+0,0* **

2.69+0.01*/1,72+0,02***

2,43+0.02* */1,36+0,01 * * *

2,18+0,01**71,65+0,02***

Активность инвертазы (мг глюкозы/г/24ч)

10

30,06+1,4

22,10+0,05**715,23+0,5***

28,40+1,3/23,42+0,5*

22.60+0,06**78,26+0,1 ***

29,80+1,2/23,50+0,4*

60

30,96+0,08

25,00+0,1 */23,31+0,08*

28,40+1,3/23,42+0,08*

24,70+0,2*722,73+0,08*

29,80+1,2/23,50+0,08*

120

25,34+0,04

24,63+0,1/22,89+0,4

24.02+0.1/22,31+0,2

23,69±0,4/21,46+0,3*

24,35+0,2/22,29+0,2

Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при п=4.

Как антибиотики, так и их смеси с фунгицидом не оказали достоверного изменения активности фосфатазы на 3-и сут. опыта (табл. 11). Однако на 30 -е сут. инкубирования активность фермента значительно снизилась по сравнению с контролем. Из антибиотиков ампициллин снизил активность фосфатазы на 40% от контроля, а смеси ампициллина и тилозина с инпутом на 45 и 50% соответственно.

Из класса гидролаз инвертаза оказалась наименее устойчива к исследуемым веществам (табл. 12). Наиболее эффективными оказались сочетания препаратов и фунгицид. На 3-и сут. инкубирования активность инвертазы снизилась на 20-25% от контроля (образцы с комплексами препаратов). К 30-м суткам инкубирования наблюдается тренд резкого снижения активности фермента на 50-60% от контроля. Восстановления активности фермента не наблюдается и через 90 сут. инкубирования образцов почвы.

Внесение антибиотиков и их смесей с фунгицидом не приводит к ингибированию пероксидазы и полифенолокидазы, а наоборот наблюдается тенденция увеличения активности ферментов на всех сроках эспозиции. Установлена отрицательная корреляция между этими ферментами с численностью аммонифицирующих бактерий (г= -0,82) и положительная корреляция с микромицетами (г=0,75).

С помощью корреляционного анализа данных выявили положительную корреляцию дегидрогеназы, инвертазы с численностью микромицетов (г=0,63, г=0,65, соответственно), каталазы с аммонификаторами (г=0,73) и обратную корреляцию фосфатазы с амилолитиками (г=-0,80). Что дает возможность судить о вкладе разных групп микроорганизмов в ферментативный пул почв.

Таблица 9 Изменение активности каталазы (мл О2/г/мин) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Сроки экспозиции (сутки)

3

30

90

М±т

S

CV, %

М±т

S

CV, %

М + т

S

CV, %

Контроль

8,0+0,05

0,42

5,20

9.9+0,12

1,07

10,82

7,3+0,07

0,59

8,05

Ампициллин

6,9+0,08*

0,70

10,21

9,2+0,15

1,39

15,12

6,7+0,08

0,70

10,36

Стрептомицин

6,7+0,08*

0,71

10,52

7,9+0,06**

0,53

6.63

7,3+0,04

0,40

5,41

Тилозин

7,3+0,06

0,55

7,57

9,1+0,15

1,33

14,72

7,3+0,07

0,64

8,74

Тромексин

7,6+0,05

0,47

6,21

8,9+0,15*

1,31

14,64

6,1+0,20**

1,80

29,38

Ализерил

6,9+0,05*

0,48

6,90

8,9+0,11*

1,01

11,33

7,1±0,10

0,92

12,94

Ампициллин+инпут

5,8+0,10**

0,86

14,87

8,1+0,14**

1,26

15,65

5,4+0,15**

1,39

25,71

Стрептомицин+инпут

5,7+0,05**

0,44

7,70

9,3+0,14

1,22

13,12

6,9+0,07*

0,66

9,61

Тилозин+инпут

6,6+0,06*

0,51

7,82

8,3+0,13**

1,18

14,33

7,0+0,05

0,45

6,36

Инпут

6,2+0,10**

0.90

14.66

8,9+0,12*

1,11

12,51

6,7+0,10*

0,87

12.86

Таблица 10

Изменение активности дегидрогеназы (мг ТФФ/г/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Сроки экспозиции (сутки)

3

30

90

М+т

5

CV, %

М±т

S

CV, %

М + т

S

CV, %

Контроль

30.1+0.48

4,29

14,26

21.2+0.15

1,31

6,17

33,6+0,57

5,13

15,27

Ампициллин

22,3+0,38**

3,38

15,16

16,4+0,27*

2,43

14,86

27,4+0,60*

5,44

19,86

Стрептомицин

20,0+0,64**

5,79

28,98

14.5+0.17**

1,51

10,44

25,9+0,61

5,51

21,30

Тилозин

10,4+0,13***

1,16

11,14

17,2+0,26

2,31

13,42

21,7+0,60**

5,41

24,94

Тромексин

19,7+0,35**

3,13

15,93

15,1+0,15**

1,34

8,90

24,7+0,71**

6,36

25,75

Ализерил

27,8+1,00*

8,96

32,23

18,7+0,13*

1,14

6,07

24,1+0,45**

4.01

16,63

Ампициллин+инпут

12,9+0,26***

2,37

18,35

11,0+0,35***

3,15

28,63

30,5+0,35*

3,12

10,24

Стрептомицин+инпут

19,6+0,32**

2,86

14,56

15,6+0,28***

2,55

16,30

24,2+0,76**

6,87

28,38

Тилозин+инпут

48,7+0,90

8,14

16,73

6,3+0,09***

0,84

13,35

26,8+1,13*

10,21

38,09

Инпут

42,9+1,04

9,35

21,80

9,9+0,17

1,51

15,27

22,6+0,45

4,06

17,93

Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при п=9.

Таблица 11

Изменение активности фосфатазы (мг Р2О5/Юг/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Сроки экспозиции (сутки)

3

30

90

М+т

5

СУ, %

М+т

су %

М ± т

S

СУ, %

Контроль

2,76+0,03

0,23

8.41

2,33+0,07

0,59

25,50

2,36+0,05

0,45

18,84

Ампициллин

2,61+0,06

0,55

21,06

1,39+0,02**

0,21

14,79

2,66+0,10

0,88

33,23

Стрептомицин

2,29+0,05*

0.46

19,94

2,32+0,07

0,62

26,69

2,40+0,12

1,11

46,18

Тилозин

2,59+0,08*

0,71

27,64

1,89+0,07*

0,62

32,50

2,04±0,05

0,47

23,18

Тромексин

2,64+0,04*

0,38

14,42

2,04+0,08

0,69

33.98

1,86+0.03*

0,30

16,29

Ализерил

2,03+0,08**

0,69

33,78

1,62+0,06*

0,57

35,23

1,51+0,02**

0,16

10,87

Ампициллин+инпут

2,52+0,04*

0,36

14,36

1,48+0,07**

0,63

42,46

1,62+0,05**

0,48

29,41

Стрентомицин+инпут

2,23+0,05**

0,42

19,06

1,29+0,03**

0,23

18,00

2,77+0,09*

0,83

30,12

Тилозин+инпут

2,45+0,04*

0,38

15,45

1,12+0,01**

0,10

8,58

2,89+0.06*

0,55

18,97

Инпут

2,65+0,03*

0,26

9,86

1,38+0,04**

0,36

25,95

2,73+0,09*

0,79

29,11

Таблица 12 Изменение активности инвертазы (мг глюкозы/г/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Сроки экспозиции (сутки)

3

30

90

М±т

S

су %

М±т

S

су %

М+т

5

СУ, %

Контроль

40,06+0,67

6,01

15,00

50,55+1,00

9,02

17,84

36,77+1,40

12,59

34,25

Ампициллин

48,62+0,72

6,47

13,30

37,65+0,78*

7,01

18,63

24,46+1,11**

10,03

41,00

Стрептомицин

36,88+0,34

3,03

8,23

45,05+0,35

3,11

6,91

33,13+0,66

5,96

18,00

Тилозин

31,37+0,29**

2,64

8,41

43,54+0,72*

6,45

14,81

32,19+0,76*

6,86

21,32

Тромексин

35,95+0,19*

1,68

4,68

33,30+0,51**

4,60

13,82

31,57+0,90*

8,12

25,72

Ализерил

37,00+0,29

2,59

6,99

34,88+0,74**

6,69

19,18

30,22+0,82*

7,37

24,37

Ампициллин+инпут

34,32+0,30*

2,68

7,82

25,65+0,46***

4,10

16,00

25.56+0,91**

8,16

31,93

Стрептомицин+инпут

32,30+0,26*

2,36

7,29

24,75+0,37***

,3,35

13.54

28,90+1,09

9,83

34,00

Тилозин+инпут

29,66+0,20**

1,77

5,97

20,59+0,26***

2,33

11,33

27,58+1,33*

11,93

43,26

Инпут

29,30+0,25**

2,27

7,76

22,28+0,24***

2,20

9,89

29,12+1,49*

1.3,45

46,20

Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001 при п=9.

Изменение интенсивности выделения СО2

Почвенное «дыхание» является важным ключевым компонентом цикла углерода и определяется, прежде всего, метаболической активностью почвенной микробиоты, почвенной фауны и корневых систем растений (Наумов, 2009). Измерения дыхания in situ позволяют оценить скорость эмиссии СОг с поверхности почвы, что характеризует интенсивность продукционных (дыхание автотрофов) и деструкционных (дыхание гетеротрофов) процессов в почве (Kuzyakov, 2006). По этой причине почвенное дыхание широко используют для оценки продуктивности экосистем и для анализа активности почвенной микробиоты (Ryan, Law, 2005). В рамках почвенной микробиологии, дыхание измеряют ex situ - в условиях лаборатории в образцах почв, из которых удалены растительные остатки. Большое количество работ, связанных с изучением влияния загрязнения на биологические параметры почв, основаны на оценках почвенного дыхания, полученных ex situ, т.е. тех, которые характеризуют микробиологическую активность.

В почвах СО2 является практически единственным летучим соединением, в виде которого происходят потери углерода. По этой причине, изучение динамики скорости продуцирования углекислоты дает возможность судить не только о напряженности биологических процессов, происходящих в почве, но и позволяет оценить потери органического вещества при минерализации (Кудеяров, 2006). На почвенное дыхание оказывают влияние многие абиотические факторы, такие как температура, влажность, реакция среды (pH) почвы. В ряде исследований удавалось связать степень изменения дыхания in situ с кислотностью (Ramsey et al., 2005а) почвы и с содержанием в ней тяжелых металлов (Ramsey et al., 20056). Эти же показатели могут объяснять и варьирование показателей дыхания ex situ (Yao et al., 2003; Stefanowicz et al., 2008).

Анализ полученных данных при инкубации загрязненных образцов выявил достаточно сложный механизм интенсивности выделения СО2 (рис.34-37). Сразу же после внесения (1 сут. инкубации) растворов биологически активных веществ наблюдается значительный поток СО2 из почвы как в контрольном образце, так и в загрязненных. Интересны полученные результаты эмиссии СО2 в контрольном образце почвы (увлажненном дистиллированной водой), где наблюдается увеличение содержания диоксида углерода. В исследованиях Л.Н. Пуртовой с соавт. (2013) было показано, что увлажнение почв на 60% от полевой влагоемкости приводит к увеличению интенсивности выделения диоксида углерода, но увлажнение 100% от полевой влагоемкости, наоборот, приводит к снижению выделения СО2. Скорее всего, это обусловлено созданием анаэробных условий и ухудшением газообмена между почвой и атмосферным воздухом.

После первого дня инкубации происходит увеличение интенсивности выделения углекислого газа во всех исследуемых образах (особенно с сочетаниями загрязнителей). Пики выделения СО2 определяются в интервале 4-6 сут., в зависимости от вида загрязнителя. По данным Н.Д. Сорокина и др. (2003) численность различных эколого-трофических групп микроорганизмов тесно коррелирует с интенсивностью их дыхания. При этом интенсивность выделения диоксида углерода гетеротрофами, как правило, не зависит от структурных изменений внутри комплексов микробоценоза, а связано с изменением их общей биомассы. Далее наблюдается достоверное снижение выделения СО2, что, скорее всего, связано с активным использованием водорастворимого органического углерода микробным сообществом. Фракция водорастворимого органического вещества является основным источником углерода для микроорганизмов, по той причине, что диффузия субстрата через микробные клеточные мембран происходит только в растворимом состоянии (Marschner, Kalbitz, 2003).

После 6-7 сут. инкубации дыхание начинает резко падать, происходит почти двукратное его снижение. Подобный тренд наблюдался в работе, выполненной С. Siewert (2001), показавшим, что с течением времени инкубации образцов почвы, скорость дыхания снижается. На 8-е сут. инкубации и далее происходит стабилизация образования СО2, что связано с тем, что на данном этапе основным субстратом для микроорганизмов становится труднодоступное органическое вещество, разложение которого дает небольшой, но достаточно постоянный выход водорастворимого органического углерода. По данным Н.Д. Сорокина и др. (1999) низкие почвенные температуры, периодическое переувлажнение и высыхание почв, слабокислая реакция почвенной среды объясняют преимущественное развитие в составе микробных комплексов бактерий (87-95 %), по сравнению с грибами. А они, в свою очередь, обладая довольно мощным ферментативным аппаратом, могут использовать в качестве источника энергии труднодоступные для большинства микроорганизмов органические соединения (Сорокин, Евграфова, 1999). На 30-е сут. эксперимента содержание СО2 в загрязненных образцах приближается к контрольным значениям, а к 60-м сут. в вариантах с комплексами препаратов интенсивность эмиссии СО2 становится ниже по сравнению с контролем.

? Контроль

сутки в Ампициллин

? Ампициллин+Инпут -----Линия тренда (Контроль)

X Инпут ----Линия тренда (Ампициллин)

Линия тренда (Ампициллин+Инпут)Линия тренда (Инпут)

Рис.34. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения ампициллина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

сутки

Контроль ? Стрептомицин

Стрсптомицип+Инпут X Инпут

Линия тренда (Контроль) ----Линия тренда (Стрептомицин)

Линия тренда (Стрептомицин+Инпут) Линия тренда (Инпут)

Рис.35. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения стрептомицина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

? Контроль

А Тилозин+Инпут

  • ---Линия тренда (Контроль)
  • ? Тилозин

X Инпут

...... Линия тренда (Фармазин)

Рис.36. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения фармазина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

сутки

  • ? Контроль
  • ---Линия тренда (Контроль)
  • ? Тро.мексин А Ализерил
  • ---Линия тренда (Тромексин) ----Линия тренда (Ализерил)

Рис.37. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения комплексных стимуляторов роста (500 мг/кг)

Подобная тенденция была выявлена при исследовании влияния полиакриламида на интенсивность дыхания почв (Голядкина, Панков, 2013), однако существенной разницы в скорости выделения СО? в обработке с полиакриламидом по сравнению с контролем не было обнаружено, в отличие от исследуемых нами веществ, когда внесение фунгицида увеличивает эмиссию СО2 практически в 3 раза по сравнению с увлажненным контролем (например, стрептомицин+инпут, 1 сут. после инкубации (рис.34). Подобно нашим результатам, в исследованиях Л.Н. Пуртовой и др. (2013), было показано, что внесение в почву минеральных удобрений в стандартных дозах (зо?боКбо) вызывает активизацию процессов интенсивности выделения углекислого газа.

Полученные результаты показывают, что почвенное дыхание - сложная функциональная характеристика. Для установления основных закономерностей в изучении интенсивности выделения СО2 в течение инкубационного периода с учетом использования антибиотических веществ необходимо проведение дальнейших исследований.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >