Влияние антибиотков на биохимические свойства чернозема
Изменение и динамика восстановления биохимических свойств чернозема в условиях острого загрязнения
Изменение ферментативной активности чернозема
Активность почвенных ферментов является хорошим диагностическим показателем плодородия почв и его изменения при различных антропогенных нагрузках (Абрамян, 1992; Галстян,1974, 1978, 1982; Звягинцев 1978; Хазиев, 1976; Казеев и др., 2004; Даденко и др., 2014). Применению ферментативной активности как диагностического показателя загрязнения почв способствуют низкая ошибка опытов и устойчивость ферментов к температурам, высушиванию, длительному хранению, протеолизу, облучению и т.п. (Звягинцев и др., 1976; Звягинцев, 1978; Даденко и др., 2014). При оценке влияния разнообразных видов загрязнения на состояние и функционирование почв показана ведущая роль ферментативной активности (Колесников и др., 2006, 2011, 2013; Казеев и др., 2010; Денисова и др., 2011).
Загрязнение чернозема антибиотиками приводит к снижению активности исследованных ферментов. Полученные результаты представлены в таблицах 8-12. С увеличением концентрации антибиотиков эффект ингибирующего действия усиливается. Смесь фармазин-нистатин на 10-е сут. опыта вызывала наибольшее подавление активности каталазы (р<0,001). На дальнейших сроках исследования наблюдалось восстановление активности каталазы, дегидрогеназы и инвертазы до контрольных значений, за исключением активности фосфатазы. Аналогично полученным результатам, в других исследованиях, было показано, что антибиотики тетрациклинового ряда ингибируют активность почвенных ферментов (каталазы и фосфатазы) на 35-55% в концентрации 300 мг/кг, по сравнению с контролем (Feng et al., 2009). Максимальное снижение активности всех исследуемых ферментов установлено на 10 сут. опыта, на дальнейших сроках, наблюдается тенденция к восстановлению их активности. Комплексы антибиотиков оказали наиболее выраженный эффект воздействия на почвенные ферменты. Например, смесь фармазин+нистатин, приводит к снижению активности каталазы, дегидрогеназы и фосфатазы более чем на 50 % (р<0,001) на 10 сутки опыта.
Ветеринарный антибиотик фармазин и его смесь с нистатином, оказала наиболее выраженное ингибирующее воздействие на активность дегидрогеназы, нежели бензилпенициллин и его смесь с нистатином. Ранее, в работах Feng и др. (2009), было показано, что антибиотики из группы тетрациклинов значительно снижают активность фосфатазы (концентрации до 1000 мг/кг почвы) нежели дегидрогеназы. Активность фосфатазы оказалась наименьшей на 10-е сутки, затем немного повысилась на 60-е сутки и снова значительно снизилась на 120-е сутки. В вариантах опыта с антибактериальными препаратами (фармазин, бензилпенициллин) наблюдается наименьшая активность инвертазы на 10-е сут. и затем ее активность возрастает и максимальна на 120-е сут. эксперимента. В вариантах же с сочетаниями препаратов на 60-е сутки активность инвертазы оказалась ниже, чем на 10-е сут., но затем ее активность увеличивается (Акименко, 2013).
При исследовании влияния антибиотиков (ампициллина, стрептомицина, тилозина) в концентрации 500 мг/кг установили, что активность каталазы снижалась на 10-15% при внесении антибиотиков и на 20-30% (например, смеси стрептомицина и тилозина с инпутом) при внесении их смесей (табл.9). На 30-е сут. инкубации наблюдается тенденция восстановления активности фермента. Из антибиотиков наиболее эффективным в отношении дегидрогеназы (табл. 10) оказался тилозин, из смесей препаратов ампициллин+инпут.
Таблица 8
Влияние антибиотиков в концентрации 100 и 600 мг/кг на ферментативную активность чернозема обыкновенного
Сутки |
Контроль |
Бензилпенициллин |
Бензилпенициллин + нистатин |
Фармазин |
Фармазин + нистатин |
Активность каталазы (мл СЬ/г/мии) |
|||||
10 |
16,43+0,03 |
11,17+0,04**710,27+0,05** |
11,97+0.04* */10,73+0,14** |
12,10+0,04*/! 1,73+0,04* |
8,80+0,08***75,77+0,08*** |
60 |
12,26+0,08 |
11,42+0,03/11,13+0,01 |
11,97+0,04/10,73+0,14 |
11,30+0,05/10,85+0,01 |
10,47+0,09*/10,16+0,02* |
120 |
11,59+0,13 |
10,00+0,01 */9,20+0.05* |
10,67+0,04/9.83+0,04 |
10,23+0,06**78,50+0,05** |
9,77+0,04*/9,07+0,11* |
Активность дегидрогеназы (мг ТФФ/г/24ч) |
|||||
10 |
31,34+0,32 |
22,60+0,69**/19,30+0,59*** |
21,50+0.48**717,38+0.06*** |
24,00+0,47* */16,47+0,19*** |
21,90+0,85**79,65+0,33*** |
60 |
33,65+0,27 |
32,30+0,08/29,42+0,26 |
29,00+0,55*724,58+0,22** |
31,50+0,15/28,66+0,13 |
27,40+0,30*723,56+0,26** |
120 |
26,30+0,02 |
22,68+0,01 */21,90+0,01* |
24.93+0.01/24,11+0,02 |
22,19+0.01*721,37+0,01* |
24,50+,01/24,29+0,02 |
Активность фосфатазы (мг Р2О5/10г/24ч) |
|||||
10 |
3,60+0,01 |
1,97+0,01 * * */1,07+0,01 * * * |
2,29+0,01 **/1,4+0,01*** |
2,50+0.01 **/1,14+0,01*** |
2,76+0,01 */1,90+0,01*** |
60 |
3,11+0,02 |
2,83+0,01/1,68+0,02*** |
2,90+0,02/1,82+0,02*** |
2.69+0,03*/1,68+0,02* * * |
2,76+0,01 */1,90+0,02*** |
120 |
3,14+0,01 |
2,15+0,02* */1,54+0,0* ** |
2.69+0.01*/1,72+0,02*** |
2,43+0.02* */1,36+0,01 * * * |
2,18+0,01**71,65+0,02*** |
Активность инвертазы (мг глюкозы/г/24ч) |
|||||
10 |
30,06+1,4 |
22,10+0,05**715,23+0,5*** |
28,40+1,3/23,42+0,5* |
22.60+0,06**78,26+0,1 *** |
29,80+1,2/23,50+0,4* |
60 |
30,96+0,08 |
25,00+0,1 */23,31+0,08* |
28,40+1,3/23,42+0,08* |
24,70+0,2*722,73+0,08* |
29,80+1,2/23,50+0,08* |
120 |
25,34+0,04 |
24,63+0,1/22,89+0,4 |
24.02+0.1/22,31+0,2 |
23,69±0,4/21,46+0,3* |
24,35+0,2/22,29+0,2 |
Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при п=4.
Как антибиотики, так и их смеси с фунгицидом не оказали достоверного изменения активности фосфатазы на 3-и сут. опыта (табл. 11). Однако на 30 -е сут. инкубирования активность фермента значительно снизилась по сравнению с контролем. Из антибиотиков ампициллин снизил активность фосфатазы на 40% от контроля, а смеси ампициллина и тилозина с инпутом на 45 и 50% соответственно.
Из класса гидролаз инвертаза оказалась наименее устойчива к исследуемым веществам (табл. 12). Наиболее эффективными оказались сочетания препаратов и фунгицид. На 3-и сут. инкубирования активность инвертазы снизилась на 20-25% от контроля (образцы с комплексами препаратов). К 30-м суткам инкубирования наблюдается тренд резкого снижения активности фермента на 50-60% от контроля. Восстановления активности фермента не наблюдается и через 90 сут. инкубирования образцов почвы.
Внесение антибиотиков и их смесей с фунгицидом не приводит к ингибированию пероксидазы и полифенолокидазы, а наоборот наблюдается тенденция увеличения активности ферментов на всех сроках эспозиции. Установлена отрицательная корреляция между этими ферментами с численностью аммонифицирующих бактерий (г= -0,82) и положительная корреляция с микромицетами (г=0,75).
С помощью корреляционного анализа данных выявили положительную корреляцию дегидрогеназы, инвертазы с численностью микромицетов (г=0,63, г=0,65, соответственно), каталазы с аммонификаторами (г=0,73) и обратную корреляцию фосфатазы с амилолитиками (г=-0,80). Что дает возможность судить о вкладе разных групп микроорганизмов в ферментативный пул почв.
Таблица 9 Изменение активности каталазы (мл О2/г/мин) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)
Сроки экспозиции (сутки) |
|||||||||
3 |
30 |
90 |
|||||||
М±т |
S |
CV, % |
М±т |
S |
CV, % |
М + т |
S |
CV, % |
|
Контроль |
8,0+0,05 |
0,42 |
5,20 |
9.9+0,12 |
1,07 |
10,82 |
7,3+0,07 |
0,59 |
8,05 |
Ампициллин |
6,9+0,08* |
0,70 |
10,21 |
9,2+0,15 |
1,39 |
15,12 |
6,7+0,08 |
0,70 |
10,36 |
Стрептомицин |
6,7+0,08* |
0,71 |
10,52 |
7,9+0,06** |
0,53 |
6.63 |
7,3+0,04 |
0,40 |
5,41 |
Тилозин |
7,3+0,06 |
0,55 |
7,57 |
9,1+0,15 |
1,33 |
14,72 |
7,3+0,07 |
0,64 |
8,74 |
Тромексин |
7,6+0,05 |
0,47 |
6,21 |
8,9+0,15* |
1,31 |
14,64 |
6,1+0,20** |
1,80 |
29,38 |
Ализерил |
6,9+0,05* |
0,48 |
6,90 |
8,9+0,11* |
1,01 |
11,33 |
7,1±0,10 |
0,92 |
12,94 |
Ампициллин+инпут |
5,8+0,10** |
0,86 |
14,87 |
8,1+0,14** |
1,26 |
15,65 |
5,4+0,15** |
1,39 |
25,71 |
Стрептомицин+инпут |
5,7+0,05** |
0,44 |
7,70 |
9,3+0,14 |
1,22 |
13,12 |
6,9+0,07* |
0,66 |
9,61 |
Тилозин+инпут |
6,6+0,06* |
0,51 |
7,82 |
8,3+0,13** |
1,18 |
14,33 |
7,0+0,05 |
0,45 |
6,36 |
Инпут |
6,2+0,10** |
0.90 |
14.66 |
8,9+0,12* |
1,11 |
12,51 |
6,7+0,10* |
0,87 |
12.86 |
Таблица 10
Изменение активности дегидрогеназы (мг ТФФ/г/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)
Сроки экспозиции (сутки) |
|||||||||
3 |
30 |
90 |
|||||||
М+т |
5 |
CV, % |
М±т |
S |
CV, % |
М + т |
S |
CV, % |
|
Контроль |
30.1+0.48 |
4,29 |
14,26 |
21.2+0.15 |
1,31 |
6,17 |
33,6+0,57 |
5,13 |
15,27 |
Ампициллин |
22,3+0,38** |
3,38 |
15,16 |
16,4+0,27* |
2,43 |
14,86 |
27,4+0,60* |
5,44 |
19,86 |
Стрептомицин |
20,0+0,64** |
5,79 |
28,98 |
14.5+0.17** |
1,51 |
10,44 |
25,9+0,61 |
5,51 |
21,30 |
Тилозин |
10,4+0,13*** |
1,16 |
11,14 |
17,2+0,26 |
2,31 |
13,42 |
21,7+0,60** |
5,41 |
24,94 |
Тромексин |
19,7+0,35** |
3,13 |
15,93 |
15,1+0,15** |
1,34 |
8,90 |
24,7+0,71** |
6,36 |
25,75 |
Ализерил |
27,8+1,00* |
8,96 |
32,23 |
18,7+0,13* |
1,14 |
6,07 |
24,1+0,45** |
4.01 |
16,63 |
Ампициллин+инпут |
12,9+0,26*** |
2,37 |
18,35 |
11,0+0,35*** |
3,15 |
28,63 |
30,5+0,35* |
3,12 |
10,24 |
Стрептомицин+инпут |
19,6+0,32** |
2,86 |
14,56 |
15,6+0,28*** |
2,55 |
16,30 |
24,2+0,76** |
6,87 |
28,38 |
Тилозин+инпут |
48,7+0,90 |
8,14 |
16,73 |
6,3+0,09*** |
0,84 |
13,35 |
26,8+1,13* |
10,21 |
38,09 |
Инпут |
42,9+1,04 |
9,35 |
21,80 |
9,9+0,17 |
1,51 |
15,27 |
22,6+0,45 |
4,06 |
17,93 |
Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при п=9.
Таблица 11
Изменение активности фосфатазы (мг Р2О5/Юг/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)
Сроки экспозиции (сутки) |
|||||||||
3 |
30 |
90 |
|||||||
М+т |
5 |
СУ, % |
М+т |
су % |
М ± т |
S |
СУ, % |
||
Контроль |
2,76+0,03 |
0,23 |
8.41 |
2,33+0,07 |
0,59 |
25,50 |
2,36+0,05 |
0,45 |
18,84 |
Ампициллин |
2,61+0,06 |
0,55 |
21,06 |
1,39+0,02** |
0,21 |
14,79 |
2,66+0,10 |
0,88 |
33,23 |
Стрептомицин |
2,29+0,05* |
0.46 |
19,94 |
2,32+0,07 |
0,62 |
26,69 |
2,40+0,12 |
1,11 |
46,18 |
Тилозин |
2,59+0,08* |
0,71 |
27,64 |
1,89+0,07* |
0,62 |
32,50 |
2,04±0,05 |
0,47 |
23,18 |
Тромексин |
2,64+0,04* |
0,38 |
14,42 |
2,04+0,08 |
0,69 |
33.98 |
1,86+0.03* |
0,30 |
16,29 |
Ализерил |
2,03+0,08** |
0,69 |
33,78 |
1,62+0,06* |
0,57 |
35,23 |
1,51+0,02** |
0,16 |
10,87 |
Ампициллин+инпут |
2,52+0,04* |
0,36 |
14,36 |
1,48+0,07** |
0,63 |
42,46 |
1,62+0,05** |
0,48 |
29,41 |
Стрентомицин+инпут |
2,23+0,05** |
0,42 |
19,06 |
1,29+0,03** |
0,23 |
18,00 |
2,77+0,09* |
0,83 |
30,12 |
Тилозин+инпут |
2,45+0,04* |
0,38 |
15,45 |
1,12+0,01** |
0,10 |
8,58 |
2,89+0.06* |
0,55 |
18,97 |
Инпут |
2,65+0,03* |
0,26 |
9,86 |
1,38+0,04** |
0,36 |
25,95 |
2,73+0,09* |
0,79 |
29,11 |
Таблица 12 Изменение активности инвертазы (мг глюкозы/г/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)
Сроки экспозиции (сутки) |
|||||||||
3 |
30 |
90 |
|||||||
М±т |
S |
су % |
М±т |
S |
су % |
М+т |
5 |
СУ, % |
|
Контроль |
40,06+0,67 |
6,01 |
15,00 |
50,55+1,00 |
9,02 |
17,84 |
36,77+1,40 |
12,59 |
34,25 |
Ампициллин |
48,62+0,72 |
6,47 |
13,30 |
37,65+0,78* |
7,01 |
18,63 |
24,46+1,11** |
10,03 |
41,00 |
Стрептомицин |
36,88+0,34 |
3,03 |
8,23 |
45,05+0,35 |
3,11 |
6,91 |
33,13+0,66 |
5,96 |
18,00 |
Тилозин |
31,37+0,29** |
2,64 |
8,41 |
43,54+0,72* |
6,45 |
14,81 |
32,19+0,76* |
6,86 |
21,32 |
Тромексин |
35,95+0,19* |
1,68 |
4,68 |
33,30+0,51** |
4,60 |
13,82 |
31,57+0,90* |
8,12 |
25,72 |
Ализерил |
37,00+0,29 |
2,59 |
6,99 |
34,88+0,74** |
6,69 |
19,18 |
30,22+0,82* |
7,37 |
24,37 |
Ампициллин+инпут |
34,32+0,30* |
2,68 |
7,82 |
25,65+0,46*** |
4,10 |
16,00 |
25.56+0,91** |
8,16 |
31,93 |
Стрептомицин+инпут |
32,30+0,26* |
2,36 |
7,29 |
24,75+0,37*** |
,3,35 |
13.54 |
28,90+1,09 |
9,83 |
34,00 |
Тилозин+инпут |
29,66+0,20** |
1,77 |
5,97 |
20,59+0,26*** |
2,33 |
11,33 |
27,58+1,33* |
11,93 |
43,26 |
Инпут |
29,30+0,25** |
2,27 |
7,76 |
22,28+0,24*** |
2,20 |
9,89 |
29,12+1,49* |
1.3,45 |
46,20 |
Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001 при п=9.
Изменение интенсивности выделения СО2
Почвенное «дыхание» является важным ключевым компонентом цикла углерода и определяется, прежде всего, метаболической активностью почвенной микробиоты, почвенной фауны и корневых систем растений (Наумов, 2009). Измерения дыхания in situ позволяют оценить скорость эмиссии СОг с поверхности почвы, что характеризует интенсивность продукционных (дыхание автотрофов) и деструкционных (дыхание гетеротрофов) процессов в почве (Kuzyakov, 2006). По этой причине почвенное дыхание широко используют для оценки продуктивности экосистем и для анализа активности почвенной микробиоты (Ryan, Law, 2005). В рамках почвенной микробиологии, дыхание измеряют ex situ - в условиях лаборатории в образцах почв, из которых удалены растительные остатки. Большое количество работ, связанных с изучением влияния загрязнения на биологические параметры почв, основаны на оценках почвенного дыхания, полученных ex situ, т.е. тех, которые характеризуют микробиологическую активность.
В почвах СО2 является практически единственным летучим соединением, в виде которого происходят потери углерода. По этой причине, изучение динамики скорости продуцирования углекислоты дает возможность судить не только о напряженности биологических процессов, происходящих в почве, но и позволяет оценить потери органического вещества при минерализации (Кудеяров, 2006). На почвенное дыхание оказывают влияние многие абиотические факторы, такие как температура, влажность, реакция среды (pH) почвы. В ряде исследований удавалось связать степень изменения дыхания in situ с кислотностью (Ramsey et al., 2005а) почвы и с содержанием в ней тяжелых металлов (Ramsey et al., 20056). Эти же показатели могут объяснять и варьирование показателей дыхания ex situ (Yao et al., 2003; Stefanowicz et al., 2008).
Анализ полученных данных при инкубации загрязненных образцов выявил достаточно сложный механизм интенсивности выделения СО2 (рис.34-37). Сразу же после внесения (1 сут. инкубации) растворов биологически активных веществ наблюдается значительный поток СО2 из почвы как в контрольном образце, так и в загрязненных. Интересны полученные результаты эмиссии СО2 в контрольном образце почвы (увлажненном дистиллированной водой), где наблюдается увеличение содержания диоксида углерода. В исследованиях Л.Н. Пуртовой с соавт. (2013) было показано, что увлажнение почв на 60% от полевой влагоемкости приводит к увеличению интенсивности выделения диоксида углерода, но увлажнение 100% от полевой влагоемкости, наоборот, приводит к снижению выделения СО2. Скорее всего, это обусловлено созданием анаэробных условий и ухудшением газообмена между почвой и атмосферным воздухом.
После первого дня инкубации происходит увеличение интенсивности выделения углекислого газа во всех исследуемых образах (особенно с сочетаниями загрязнителей). Пики выделения СО2 определяются в интервале 4-6 сут., в зависимости от вида загрязнителя. По данным Н.Д. Сорокина и др. (2003) численность различных эколого-трофических групп микроорганизмов тесно коррелирует с интенсивностью их дыхания. При этом интенсивность выделения диоксида углерода гетеротрофами, как правило, не зависит от структурных изменений внутри комплексов микробоценоза, а связано с изменением их общей биомассы. Далее наблюдается достоверное снижение выделения СО2, что, скорее всего, связано с активным использованием водорастворимого органического углерода микробным сообществом. Фракция водорастворимого органического вещества является основным источником углерода для микроорганизмов, по той причине, что диффузия субстрата через микробные клеточные мембран происходит только в растворимом состоянии (Marschner, Kalbitz, 2003).
После 6-7 сут. инкубации дыхание начинает резко падать, происходит почти двукратное его снижение. Подобный тренд наблюдался в работе, выполненной С. Siewert (2001), показавшим, что с течением времени инкубации образцов почвы, скорость дыхания снижается. На 8-е сут. инкубации и далее происходит стабилизация образования СО2, что связано с тем, что на данном этапе основным субстратом для микроорганизмов становится труднодоступное органическое вещество, разложение которого дает небольшой, но достаточно постоянный выход водорастворимого органического углерода. По данным Н.Д. Сорокина и др. (1999) низкие почвенные температуры, периодическое переувлажнение и высыхание почв, слабокислая реакция почвенной среды объясняют преимущественное развитие в составе микробных комплексов бактерий (87-95 %), по сравнению с грибами. А они, в свою очередь, обладая довольно мощным ферментативным аппаратом, могут использовать в качестве источника энергии труднодоступные для большинства микроорганизмов органические соединения (Сорокин, Евграфова, 1999). На 30-е сут. эксперимента содержание СО2 в загрязненных образцах приближается к контрольным значениям, а к 60-м сут. в вариантах с комплексами препаратов интенсивность эмиссии СО2 становится ниже по сравнению с контролем.

? Контроль |
сутки в Ампициллин |
? Ампициллин+Инпут -----Линия тренда (Контроль) |
X Инпут ----Линия тренда (Ампициллин) |
Линия тренда (Ампициллин+Инпут)Линия тренда (Инпут)
Рис.34. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения ампициллина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

сутки
Контроль ? Стрептомицин
Стрсптомицип+Инпут X Инпут
Линия тренда (Контроль) ----Линия тренда (Стрептомицин)
Линия тренда (Стрептомицин+Инпут) Линия тренда (Инпут)
Рис.35. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения стрептомицина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

? Контроль
А Тилозин+Инпут
- ---Линия тренда (Контроль)
- ? Тилозин
X Инпут
...... Линия тренда (Фармазин)
Рис.36. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения фармазина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

сутки
- ? Контроль
- ---Линия тренда (Контроль)
- ? Тро.мексин А Ализерил
- ---Линия тренда (Тромексин) ----Линия тренда (Ализерил)
Рис.37. Интенсивность выделения СО2 черноземом после внесения комплексных стимуляторов роста (500 мг/кг)
Подобная тенденция была выявлена при исследовании влияния полиакриламида на интенсивность дыхания почв (Голядкина, Панков, 2013), однако существенной разницы в скорости выделения СО? в обработке с полиакриламидом по сравнению с контролем не было обнаружено, в отличие от исследуемых нами веществ, когда внесение фунгицида увеличивает эмиссию СО2 практически в 3 раза по сравнению с увлажненным контролем (например, стрептомицин+инпут, 1 сут. после инкубации (рис.34). Подобно нашим результатам, в исследованиях Л.Н. Пуртовой и др. (2013), было показано, что внесение в почву минеральных удобрений в стандартных дозах (зо?боКбо) вызывает активизацию процессов интенсивности выделения углекислого газа.
Полученные результаты показывают, что почвенное дыхание - сложная функциональная характеристика. Для установления основных закономерностей в изучении интенсивности выделения СО2 в течение инкубационного периода с учетом использования антибиотических веществ необходимо проведение дальнейших исследований.