Влияние антибиотков на биохимические свойства чернозема

Изменение и динамика восстановления биохимических свойств чернозема в условиях острого загрязнения

Изменение ферментативной активности чернозема

Активность почвенных ферментов является хорошим диагностическим показателем плодородия почв и его изменения при различных антропогенных нагрузках (Абрамян, 1992; Галстян,1974, 1978, 1982; Звягинцев 1978; Хазиев, 1976; Казеев и др., 2004; Даденко и др., 2014). Применению ферментативной активности как диагностического показателя загрязнения почв способствуют низкая ошибка опытов и устойчивость ферментов к температурам, высушиванию, длительному хранению, протеолизу, облучению и т.п. (Звягинцев и др., 1976; Звягинцев, 1978; Даденко и др., 2014). При оценке влияния разнообразных видов загрязнения на состояние и функционирование почв показана ведущая роль ферментативной активности (Колесников и др., 2006, 2011, 2013; Казеев и др., 2010; Денисова и др., 2011).

Загрязнение чернозема антибиотиками приводит к снижению активности исследованных ферментов. Полученные результаты представлены в таблицах 8-12. С увеличением концентрации антибиотиков эффект ингибирующего действия усиливается. Смесь фармазин-нистатин на 10-е сут. опыта вызывала наибольшее подавление активности каталазы (р<0,001). На дальнейших сроках исследования наблюдалось восстановление активности каталазы, дегидрогеназы и инвертазы до контрольных значений, за исключением активности фосфатазы. Аналогично полученным результатам, в других исследованиях, было показано, что антибиотики тетрациклинового ряда ингибируют активность почвенных ферментов (каталазы и фосфатазы) на 35-55% в концентрации 300 мг/кг, по сравнению с контролем (Feng et al., 2009). Максимальное снижение активности всех исследуемых ферментов установлено на 10 сут. опыта, на дальнейших сроках, наблюдается тенденция к восстановлению их активности. Комплексы антибиотиков оказали наиболее выраженный эффект воздействия на почвенные ферменты. Например, смесь фармазин+нистатин, приводит к снижению активности каталазы, дегидрогеназы и фосфатазы более чем на 50 % (р<0,001) на 10 сутки опыта.

Ветеринарный антибиотик фармазин и его смесь с нистатином, оказала наиболее выраженное ингибирующее воздействие на активность дегидрогеназы, нежели бензилпенициллин и его смесь с нистатином. Ранее, в работах Feng и др. (2009), было показано, что антибиотики из группы тетрациклинов значительно снижают активность фосфатазы (концентрации до 1000 мг/кг почвы) нежели дегидрогеназы. Активность фосфатазы оказалась наименьшей на 10-е сутки, затем немного повысилась на 60-е сутки и снова значительно снизилась на 120-е сутки. В вариантах опыта с антибактериальными препаратами (фармазин, бензилпенициллин) наблюдается наименьшая активность инвертазы на 10-е сут. и затем ее активность возрастает и максимальна на 120-е сут. эксперимента. В вариантах же с сочетаниями препаратов на 60-е сутки активность инвертазы оказалась ниже, чем на 10-е сут., но затем ее активность увеличивается (Акименко, 2013).

При исследовании влияния антибиотиков (ампициллина, стрептомицина, тилозина) в концентрации 500 мг/кг установили, что активность каталазы снижалась на 10-15% при внесении антибиотиков и на 20-30% (например, смеси стрептомицина и тилозина с инпутом) при внесении их смесей (табл.9). На 30-е сут. инкубации наблюдается тенденция восстановления активности фермента. Из антибиотиков наиболее эффективным в отношении дегидрогеназы (табл. 10) оказался тилозин, из смесей препаратов ампициллин+инпут.

Таблица 8

Влияние антибиотиков в концентрации 100 и 600 мг/кг на ферментативную активность чернозема обыкновенного

Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при п=4.

Как антибиотики, так и их смеси с фунгицидом не оказали достоверного изменения активности фосфатазы на 3-и сут. опыта (табл. 11). Однако на 30 -е сут. инкубирования активность фермента значительно снизилась по сравнению с контролем. Из антибиотиков ампициллин снизил активность фосфатазы на 40% от контроля, а смеси ампициллина и тилозина с инпутом на 45 и 50% соответственно.

Из класса гидролаз инвертаза оказалась наименее устойчива к исследуемым веществам (табл. 12). Наиболее эффективными оказались сочетания препаратов и фунгицид. На 3-и сут. инкубирования активность инвертазы снизилась на 20-25% от контроля (образцы с комплексами препаратов). К 30-м суткам инкубирования наблюдается тренд резкого снижения активности фермента на 50-60% от контроля. Восстановления активности фермента не наблюдается и через 90 сут. инкубирования образцов почвы.

Внесение антибиотиков и их смесей с фунгицидом не приводит к ингибированию пероксидазы и полифенолокидазы, а наоборот наблюдается тенденция увеличения активности ферментов на всех сроках эспозиции. Установлена отрицательная корреляция между этими ферментами с численностью аммонифицирующих бактерий (г= -0,82) и положительная корреляция с микромицетами (г=0,75).

С помощью корреляционного анализа данных выявили положительную корреляцию дегидрогеназы, инвертазы с численностью микромицетов (г=0,63, г=0,65, соответственно), каталазы с аммонификаторами (г=0,73) и обратную корреляцию фосфатазы с амилолитиками (г=-0,80). Что дает возможность судить о вкладе разных групп микроорганизмов в ферментативный пул почв.

Таблица 9 Изменение активности каталазы (мл О₂/г/мин) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Таблица 10

Изменение активности дегидрогеназы (мг ТФФ/г/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при п=9.

Таблица 11

Изменение активности фосфатазы (мг Р₂О₅/Юг/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Таблица 12 Изменение активности инвертазы (мг глюкозы/г/24ч) при загрязнении антибиотиками и их смесями с фунгицидом (500 мг/кг)

Примечание. Достоверные отличия по отношению к контролю: *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001 при п=9.

Изменение интенсивности выделения СО₂

Почвенное «дыхание» является важным ключевым компонентом цикла углерода и определяется, прежде всего, метаболической активностью почвенной микробиоты, почвенной фауны и корневых систем растений (Наумов, 2009). Измерения дыхания in situ позволяют оценить скорость эмиссии СОг с поверхности почвы, что характеризует интенсивность продукционных (дыхание автотрофов) и деструкционных (дыхание гетеротрофов) процессов в почве (Kuzyakov, 2006). По этой причине почвенное дыхание широко используют для оценки продуктивности экосистем и для анализа активности почвенной микробиоты (Ryan, Law, 2005). В рамках почвенной микробиологии, дыхание измеряют ex situ - в условиях лаборатории в образцах почв, из которых удалены растительные остатки. Большое количество работ, связанных с изучением влияния загрязнения на биологические параметры почв, основаны на оценках почвенного дыхания, полученных ex situ, т.е. тех, которые характеризуют микробиологическую активность.

В почвах СО₂ является практически единственным летучим соединением, в виде которого происходят потери углерода. По этой причине, изучение динамики скорости продуцирования углекислоты дает возможность судить не только о напряженности биологических процессов, происходящих в почве, но и позволяет оценить потери органического вещества при минерализации (Кудеяров, 2006). На почвенное дыхание оказывают влияние многие абиотические факторы, такие как температура, влажность, реакция среды (pH) почвы. В ряде исследований удавалось связать степень изменения дыхания in situ с кислотностью (Ramsey et al., 2005а) почвы и с содержанием в ней тяжелых металлов (Ramsey et al., 20056). Эти же показатели могут объяснять и варьирование показателей дыхания ex situ (Yao et al., 2003; Stefanowicz et al., 2008).

Анализ полученных данных при инкубации загрязненных образцов выявил достаточно сложный механизм интенсивности выделения СО₂ (рис.34-37). Сразу же после внесения (1 сут. инкубации) растворов биологически активных веществ наблюдается значительный поток СО₂ из почвы как в контрольном образце, так и в загрязненных. Интересны полученные результаты эмиссии СО₂ в контрольном образце почвы (увлажненном дистиллированной водой), где наблюдается увеличение содержания диоксида углерода. В исследованиях Л.Н. Пуртовой с соавт. (2013) было показано, что увлажнение почв на 60% от полевой влагоемкости приводит к увеличению интенсивности выделения диоксида углерода, но увлажнение 100% от полевой влагоемкости, наоборот, приводит к снижению выделения СО₂. Скорее всего, это обусловлено созданием анаэробных условий и ухудшением газообмена между почвой и атмосферным воздухом.

После первого дня инкубации происходит увеличение интенсивности выделения углекислого газа во всех исследуемых образах (особенно с сочетаниями загрязнителей). Пики выделения СО₂ определяются в интервале 4-6 сут., в зависимости от вида загрязнителя. По данным Н.Д. Сорокина и др. (2003) численность различных эколого-трофических групп микроорганизмов тесно коррелирует с интенсивностью их дыхания. При этом интенсивность выделения диоксида углерода гетеротрофами, как правило, не зависит от структурных изменений внутри комплексов микробоценоза, а связано с изменением их общей биомассы. Далее наблюдается достоверное снижение выделения СО₂, что, скорее всего, связано с активным использованием водорастворимого органического углерода микробным сообществом. Фракция водорастворимого органического вещества является основным источником углерода для микроорганизмов, по той причине, что диффузия субстрата через микробные клеточные мембран происходит только в растворимом состоянии (Marschner, Kalbitz, 2003).

После 6-7 сут. инкубации дыхание начинает резко падать, происходит почти двукратное его снижение. Подобный тренд наблюдался в работе, выполненной С. Siewert (2001), показавшим, что с течением времени инкубации образцов почвы, скорость дыхания снижается. На 8-е сут. инкубации и далее происходит стабилизация образования СО₂, что связано с тем, что на данном этапе основным субстратом для микроорганизмов становится труднодоступное органическое вещество, разложение которого дает небольшой, но достаточно постоянный выход водорастворимого органического углерода. По данным Н.Д. Сорокина и др. (1999) низкие почвенные температуры, периодическое переувлажнение и высыхание почв, слабокислая реакция почвенной среды объясняют преимущественное развитие в составе микробных комплексов бактерий (87-95 %), по сравнению с грибами. А они, в свою очередь, обладая довольно мощным ферментативным аппаратом, могут использовать в качестве источника энергии труднодоступные для большинства микроорганизмов органические соединения (Сорокин, Евграфова, 1999). На 30-е сут. эксперимента содержание СО₂ в загрязненных образцах приближается к контрольным значениям, а к 60-м сут. в вариантах с комплексами препаратов интенсивность эмиссии СО₂ становится ниже по сравнению с контролем.

Линия тренда (Ампициллин+Инпут)Линия тренда (Инпут)

Рис.34. Интенсивность выделения СО₂ черноземом после внесения ампициллина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

сутки

Контроль ? Стрептомицин

Стрсптомицип+Инпут X Инпут

Линия тренда (Контроль) ----Линия тренда (Стрептомицин)

Линия тренда (Стрептомицин+Инпут) Линия тренда (Инпут)

Рис.35. Интенсивность выделения СО₂ черноземом после внесения стрептомицина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

? Контроль

А Тилозин+Инпут

• ---Линия тренда (Контроль)
• ? Тилозин

X Инпут

...... Линия тренда (Фармазин)

Рис.36. Интенсивность выделения СО₂ черноземом после внесения фармазина и его комплекса с фунгицидом «Инпут» (500 мг/кг)

сутки

• ? Контроль
• ---Линия тренда (Контроль)
• ? Тро.мексин А Ализерил
• ---Линия тренда (Тромексин) ----Линия тренда (Ализерил)

Рис.37. Интенсивность выделения СО₂ черноземом после внесения комплексных стимуляторов роста (500 мг/кг)

Подобная тенденция была выявлена при исследовании влияния полиакриламида на интенсивность дыхания почв (Голядкина, Панков, 2013), однако существенной разницы в скорости выделения СО? в обработке с полиакриламидом по сравнению с контролем не было обнаружено, в отличие от исследуемых нами веществ, когда внесение фунгицида увеличивает эмиссию СО2 практически в 3 раза по сравнению с увлажненным контролем (например, стрептомицин+инпут, 1 сут. после инкубации (рис.34). Подобно нашим результатам, в исследованиях Л.Н. Пуртовой и др. (2013), было показано, что внесение в почву минеральных удобрений в стандартных дозах (зо?боКбо) вызывает активизацию процессов интенсивности выделения углекислого газа.

Полученные результаты показывают, что почвенное дыхание - сложная функциональная характеристика. Для установления основных закономерностей в изучении интенсивности выделения СО₂ в течение инкубационного периода с учетом использования антибиотических веществ необходимо проведение дальнейших исследований.