Влияние антибиотков на численность и структуру микробоценоза чернозема

Изменение численности и динамика восстановления основных групп почвенных микроорганизмов в условиях острого загрязнения

Функционирование почвенной микробиоты является наиболее сложным и важным разделом почвенной диагностики. Микроорганизмы как биоиндикаторы водных систем достаточно широко используются в гигиене и водном хозяйстве, для почвенных систем делаются только лишь первые шаги в этом направлении. Исследованиями О.Е. Марфениной с соавторами (1983, 1988, 1994) показано, что при возрастающих антропогенных воздействиях происходит изменение грибного разнообразия в почве. В связи, с чем связано упрощение видовой структуры, появление нехарактерных видов, снижение биоразнообразия, изменение представленности отдельных видов, расширение круга потенциальных доминантов и др. Аналогичные изменения при антропогенном воздействии на почвы отмечены и для микрофлоры в целом (Гузев, 1988; Гузин, Левин, 1991; Романовская и др., 1999). Жизнедеятельность почвенных микроорганизмов является хорошим диагностическим показателем плодородия почв и его изменения в результате воздействия разных антропогенных факторов. Устойчивость микроорганизмов к разным классам антибиотиков относится к числу наиболее острых проблем современности. Возникновение и быстрое ее распространение создает угрожающую ситуацию не только в медицине, но и в ветеринарии, животноводстве, растениеводстве, аквакультуре.

Внесение в почву антибиотиков и их смесей с фунгицидами приводит к изменению биологических свойств чернозема, наблюдалось достоверное снижение всех исследуемых показателей. Степень снижения зависела от природы антибиотика, его концентрации и продолжительности воздействия.

Изменение численности и динамика восстановления аммонифицирующих бактерий

Аммонифицирующие бактерии являются важной группой микроорганизмов, осуществляющих в почве процессы разложения остатков растений, трупов животных, мочевины и т.д. Процесс аммонификации представляет собой микробиологическую трансформацию азота органических соединений в ионы аммония или аммиак. Реакции разложения органического вещества протекают в аэробных условиях и сопровождаются образованием углекислого газа. В процессах гниения принимают участие различные аэробные бактерии (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus), анаэробы (Clostridium sporogenes, Clostridium Putrificum) и уробактерии (Urobacillus pasteuri, Sarcina ureae) (Шлегель, 1987).

Результаты исследования показали, что антибиотики оказывают ингибирующее воздействие на численность аммонификаторов, подобные результаты были получены и в других исследованиях (Colinas et al., 1994; Westergaard et al., 2001; Kong et al., 2006). Несмотря на это, в литературе имеются данные и о положительном влиянии антибиотиков в микродозах на активность микроорганизмов (Schmitt et al., 2004).

С помощью корреляционного анализа установили тесную связь между концентрацией антибиотиков и изменением численности микроорганизмов (г= -0,68-0,86). Аналогичным образом, в других исследованиях показано, что степень влияния антибиотиков зависит от их концентрации, чем выше доза, тем сильнее эффект воздействия (Herron et al., 1998). Например, показано, что внесение в почву сульфахлоропиридазина, на первых сроках исследования, приводит к ингибированию численности микроорганизмов, последующее же увеличение концентрации антибиотика вызывает развитие устойчивости у микроорганизмов (Schmitt et al., 2004). Изменение численности аммонифицирующих бактерий чернозема при загрязнении антибиотиками показано на рисунках 10-14.

Наибольшее ингибирующее воздействие в концентрации 100 мг/кг на численность аммонификаторов, оказывает смесь ветеринарного антибиотика фармазина и нистатина, в то время как смесь медицинского антибиотика бензилпенициллина и нистатина оказывает меньшее ингибирующее воздействие. Другими исследованиями (Feng et al., 2009), так же отмечен эффект снижения ингибирующей способности антибактериальных препаратов в присутствии фунгицидных и проявлении синергетических эффектов комплексов антибиотиков одинаково направленного действия (Cernohorska, Votava, 2008). Однако причины таких эффектов все еще не выяснены. Напротив, при повышении концентрации (600 мг/кг) антибактериальные антибиотики приводят к наибольшему ингибированию численности аммонификаторов, нежели сочетания с фунгицидным антибиотиком. На дальнейших сроках исследования во всех исследуемых концентрациях наблюдается тенденция восстановления численности аммонифицирующих бактерий: в образцах с концентрациями 100 мг/кг наблюдается практически полное восстановление, а при концентрации 600 мг/кг - до 85% для смесей антибиотиков (р<0,05) и 60% (р<0,01) для антибактериальных антибиотиков.

Подобные данные по динамике и восстановлению численности аммонификаторов были получены в лабораторных модельных исследованиях с разными видами излучения (Денисова и др., 2005; Денисова, Казеев, 2008; Денисова, Колесников, 2009; Денисова и др., 2011). Например, численность бактерий-аммонификаторов во всех вариантах с у-излучением увеличивается, максимальные значения численности наблюдаются на 30 сутки, затем их численность снова снижается и на 90 сутки инкубирования приближается к начальным значениям (Денисова и др., 2005). При загрязнении нефтью и нефтепродуктами (Колесников и др., 2006, 2010) и тяжелыми металлами (Колесников и др., 2011, 2013, 2014) даже через 360 дней численность микроорганизмов в почве полностью не восстанавливается. Однако в сравнении с эффектом стерилизации высокими температурами (Малыгина, Казе-ев, 2010) и действием пестицидов (Казеев и др., 2010), воздействие антибиотиков на почвенные микроорганизмы носит более пролонгированный характер, например, численность микроорганизмов при стерилизации почв высокими температурами восстанавливается до контрольных значений уже на 60-е сут. опыта.

? Фармазин

А Фармазин+Нистатин

.........Линия тренда (Фармазин)

  • ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин)
  • ? Бензилпенициллин

х Бензилпснициллин+нистатин

  • ----Линия тренда (Бензилпенициллин)
  • ------Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис. 10. Динамика численности аммонификаторов при загрязнении чернозема антибиотиками (100 мг/кг)

? Фармазин

? Фармазин+Нистатин

-----Линия тренда (Фармазин)

  • ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин)
  • ? Бензилпенициллин

х Бснзилпснициллин+нистатин

  • ----Линия тренда бензилпенициллин
  • ------ Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис.11. Динамика численности аммонификаторов при загрязнении чернозема антибиотиками (300 мг/кг)

? Фармазин

л Фармазип+Нистатин

  • -----Линия аренда (Фармазин)
  • ------Линия тренда (Фармазип+Нистатин)
  • ? Бензилпенициллин

х Бензилпснициллин+нистатин

  • ---Линия тренда(Бензилпенициллин)
  • ----Линия тренда (Бспзилпснициллин+Нистатин)

Рис. 12. Динамика численности аммонификаторов при загрязнении чернозема антибиотиками (450 мг/кг)

  • ? Фармазин ? Бензилпенициллин
  • ? Фармазин+Нистатин х Бензилпенициллин+нистатин
  • -----Линия тренда (Фармазин) ----Линия тренда (Бензилпенициллин)
  • ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин) ------Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис. 13. Динамика численности аммонификаторов при загрязнении чернозема антибиотиками (600 мг/кг)

Ампициллин, стрептомицин и тилозин (концентрация 500 мг/кг) снижают численность бактерий-аммонификаторов более чем на 50% от контроля. Наибольший эффект воздействия оказывает стрептомицин (снижение на 85% от контроля, р<0,001). Фунгицид не оказывает достоверного подавляющего воздействия на численность аммонификаторов. Однако в сочетании с медицинскими и ветеринарными антибиотиками численность бактерий-аммонификаторов снижается в большей степени (рис. 14), что свидетельствует о синергизме антибиотиков и фунгицидов и усилении их отрицательного воздействия. После 30 сут. инкубации численность бактерий незначительно увеличивается в образцах с антибиотиками, а в образцах с различными комбинациями препаратов восстановления не происходит. Например, при действии смесей стрептомицин+инпут и тилозин+инпут численность аммонификатов по сравнению с 3 сут. снижается еще на 2 и 3 %, соответственно. В дальнейшем прослеживается незначительная тенденция к восстановлению численности бактерий-аммонификаторов в вариантах только лишь с антибиотиками, что нельзя сказать об их сочетаниях с фунгицидом. Например, восстановление численности бактерий (смесь стрептомицин+инпут) не наблюдается и на 90 сут. инкубации, разница в

численности бактерий по сравнению с контролем составляет около 80%.

^Ампициллин ^Стрептомицин ЕЗТилозин S Ампициллин+Инпут

? Стрептомицин+Инпут 0 Тилозин+Инпут ИИнпут

Рис. 14. Динамика численности аммонификаторов при загрязнении чернозема антибиотиками и комплексами с фунгицидом (500 мг/кг)

Изменение численности и динамика восстановления амилолитических бактерий

Изменение численности и динамика восстановления амилолитических бактерий чернозема под влиянием антибиотиков показана на рисунках 15-19.

Концентрации антибиотиков 100 мг/кг не оказали статистически достоверного ингибирующего воздействия на численность амилолитиков. Разница в численности амилолитиков на 10-е и 120-е сут. практически отсутствует. При внесении концентраций 600 мг/кг наблюдается снижение численности данной группы бактерий, причем наиболее выраженное подавляющее воздействие оказывают смеси антибиотиков. В других исследованиях установлено, что сульфонамидные антибиотики (Thiele-Bruhn, Beck, 2005), тетрациклин, триметоприм (Wunder et al., 2013) в концентрациях 300-500 мг/кг оказывают значительное ингибирующее воздействие на численность амилолитических бактерий.

Численность амилолитических бактерий, в отличие от аммонифицирующих не восстанавливается полностью на 120-е сут. исследования. Но, в целом, на протяжении всех сроков инкубирования, амилолитические бактерии показали большую устойчивость к воздействию исследуемых антибиотиков. Так же в отличие от аммонификаторов, смеси антибиотиков оказали наиболее сильное подавляющее воздействие на численность данной группы бактерий, чем антибактериальные антибиотики.

  • ? Фармазин ? Бензилпенициллин
  • ? Фармазин+Нистатин х Бензилпенициллин+нистатин
  • -----Линия тренда (Фармазин) ----Линия тренда (Бензилпенициллин)
  • ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин) ------Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)
  • 100
  • 90
  • 80
  • 70
  • 60
  • 50
  • 20
  • 40
  • 60
  • 80
  • 100

сутки

120

Фармазин

Фармазин+Нистатин

Линия тренда (Фармазин)

Линия тренда (Фармазин+Нистатин)

? Бензилпенициллин

х Бензилпенициллин+нистатин

  • ----Линия тренда (Бензилпенициллин)
  • ------линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис. 16. Динамика численности амилолитиков при загрязнении чернозема антибиотиками (300 мг/кг)

? Фармазин

А Фармазин+Нистатин

-----Линия тренда (Фармазин)

  • ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин)
  • ? Бензилпенициллин

х Бензилпенициллин+нистатин

  • ---Линия тренда(Бензилпенициллин)
  • ----Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис. 17. Динамика численности амилолитиков при загрязнении чернозема антибиотиками (450 мг/кг)

  • 100
  • 90
  • 80
  • 70
  • 60
  • 50

О 20 40

,сутки

60 80 100 120

Фармазин

Фармазин+Нистатин

Линия тренда (Фармазин)

Линия тренда (Фармазин+Нистатин)

? Бензилпенициллин

X Бензилпенициллин+нистатин

  • ----Линия тренда (Бензилпенициллин)
  • ------Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис. 18. Динамика численности амилолитиков при загрязнении чернозема антибиотиками (600 мг/кг)

Внесение в почву стрептомицина, тилозина и ампициллина в концентрации 500 мг/кг практически не приводит к изменению численности бак-терий-амилолитиков (рис. 19). Но, при комплексном воздействии антибиотиков с фунгицидом, как и при действии фунгицида, численность бактерий снижается. Бактерии оказались наименее устойчивы к фунгициду, наиболее к ветеринарному антибиотику тилозину (3-и сут. инкубации). Наименьшая численность бактерий обнаруживается при внесении в почву фунгицида. Восстановление численности амилолитиков при внесении смесей антибиотиков не наблюдается, а наоборот снижается и на 90 сут. опыта.

Динамика численности амилолитиков при загрязнении чернозема антибиотиками и комплексами с фунгицидом (500 мг/кг)

Рис. 19. Динамика численности амилолитиков при загрязнении чернозема антибиотиками и комплексами с фунгицидом (500 мг/кг)

Изменение численности и динамика восстановления микромицетов

Почвенные микромицеты составляют неизменный компонент биоценозов во всех их звеньях: взаимоотношениях с высшими растениями, почвенной фауной, бактериями, круговороте веществ и создании почвенного плодородия, взаимосвязи с твердой, жидкой и газообразной фазами почвы.

Касаясь вопроса о роли микроскопических грибов в почвообразовательных процессах, следует заметить, что почвенные грибы, продуцирую щие антибиотики, непосредственно принимают участие в синтезе гумуса и гумусоподобных веществ в почве. Химическими исследованиями раскрыта связь между структурой гумуса со строением ряда антибиотических веществ, образованных почвенными микроскопическими грибами. В более гумусных почвах преобладают грибы - продуценты антибиотиков с более сложной полициклической структурой (Воробьев и др., 2001).

Что касается действия противогрибкового препарата - нистатина, то ранее (Малыгина, Казеев, 2011) было показано, что нистатин не снижает численности почвенных бактерий, но подавляет рост и развитие почвенных микромицетов (рис.20), что связано с природой антибиотика. Из ферментов, нистатин в большей степени ингибирует активность гидролаз (инвертаза), нежели оксидоредуктаз (каталаза и дегидрогеназа) (рис.21).

Влияние антибиотика - нистатина на численность микроорганизмов чернозема обыкновенного

Рис. 20. Влияние антибиотика - нистатина на численность микроорганизмов чернозема обыкновенного

Влияние антибиотика - нистатина на ферментативную активность чернозема обыкновенного

Рис. 21. Влияние антибиотика - нистатина на ферментативную активность чернозема обыкновенного

Изменение численности микромицетов чернозема обыкновенного при загрязнении антибиотиками показано на рисунках 22-26. Как и ожидалось, антибактериальные антибиотики (бензилпенициллин, фармазин), не вызвали статистически достоверных изменений численности микромицетов, в отличие от их сочетаний с фунгицидом нистатином. На 10-е сут. опыта при воздействии смесей антибиотиков, численность микромицетов снижается на 45-55% (р<0,01), однако затем прослеживается тенденция к восстановлению численности микромицетов до 80% от контроля, однако полного восстановления не происходит. Смеси антибиотиков (концентрация 600 мг/кг) показали наибольшее ингибирующее действие на численность микромицетов. По степени ингибирования смеси нистатина с бензилпенициллином и фармазином практически не отличаются. Так же наблюдается тенденция восстановления численности 65% от контроля (р<0,01). В образцах почв с антибактериальными антибиотиками (600 мг/кг) наблюдается увеличение численности микромицетов по сравнению с контролем. Численность микромицетов на 120-е сут. опыта превышает контроль на 20% (р<0,05). Скорее всего, это объясняется адаптацией и заселением микроми-цетами экологической ниши, в связи с устранением конкуренции со стороны бактерий.

? Фармазин ? Бензилпенициллин

А Фармазин+Нистатин х Бензилпенициллин+нистатин

-----Линия тренда (Фармазин) ----Линия тренда (Бензилпенициллин) ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин) ________ Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис.22. Динамика численности микромицетов при загрязнении чернозема антибиотиками (100 мг/кг)

? Фармазин

? Фармазин+Нистатин

-----Линия тренда (Фармазин)

  • ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин)
  • ? Бензилпенициллин

х Бензилпенициллин+нистатин

  • ----Линия тренда (Бензилпенициллин)
  • ------Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис.23. Динамика численности микромицетов при загрязнении чернозема антибиотиками (300 мг/кг)

  • ? Фармазин ? Бензилпенициллин
  • ? Фармазин+Нистатин х Бензилпенициллин+нистатин
  • -----Линия тренда (Фармазин) ----Линия тренда (Бензилпенициллин)
  • ------Линия тренда (Фармазин+Нистатин)) ------Линия тренда (Бензилпенициллин+Нистатин)

Рис.24. Динамика численности микромицетов при загрязнении чернозема антибиотиками (450 мг/кг)

Фармазин

Фармазин+Нистатин

Полиномиальная (Фармазин)

Полиномиальная (Фармазин+Нистатин)

? Бензилпенициллин

х Бензилпенициллин+нистатин

  • ---Полиномиальная (Бензилпенициллин)
  • ----Полиномиальная (Бензилпенициллин+нистатин
Динамика численности микромицетов при загрязнении чернозема антибиотиками и комплексами с фунгицидом (500 мг/кг))

Рис.26. Динамика численности микромицетов при загрязнении чернозема антибиотиками и комплексами с фунгицидом (500 мг/кг))

Внесение смесей препаратов значительно снижает обилие микромицетов (рис.26). Максимальный эффект оказывает фунгицид инпут и смесь ам-пициллин+инпут. Обилие микромицетов снижается на 43 и 30% соответственно. Аналогично с амилолитическими бактериями, численность микромицетов под действием смесей препаратов снижается на протяжении всего периода инкубации. В вариантах с ампициллином и стрептомицином происходит незначительное увеличение численности микромицетов по сравнению с контролем, и на 90 сутки опыта численность микромицетов в варианте с ампициллином превышает контроль практически в два раза (р<0,05).

Изменение обилия бактерий р. Azotobacter

Бактерии р. Azotobacter оказались менее чувствительными к вносимым веществам (рис.27). Изменение обилия бактерий наблюдали лишь на 10 сутки инкубации (в опыте с антибиотиками) (снижение на 10% от контроля при воздействии фармазина и на 20% при воздействии смеси фармазин-нистатин), и на 3 сутки (в опыте со смесями антибиотиков и фунгицида)

(снижение на 30-40% от контроля при воздействии ампициллина и стрептомицина соответственно, и на 50-60%, при воздействии смеси ампицил-лин+инпут и стрептомицин+инпут, соответственно). На дальнейших сроках исследования не наблюдали изменений обилия данного рода бактерий. При этом бактерии р. Azotobacter были чувствительнее к загрязнению нефтью и нефтепродуктами, тяжелыми металлами, ионизирующему излучению, чем другие группы почвенных микроорганизмов (Денисова и др., 2011; Колес-

Изменение обилия бактерий р.Azotobacter при загрязнении чернозема антибиотиками и их комплексами с фунгицидом

Рис.27. Изменение обилия бактерий р.Azotobacter при загрязнении чернозема антибиотиками и их комплексами с фунгицидом

Изменение общей численности бактерий и динамика их восст ановления

Методом люминесцентной микроскопии установили снижение общей численности бактерий при загрязнении чернозема антибиотиками (табл. 7). Между концентрацией антибиотиков и численностью бактерий установлена тесная корреляция (г= -0,85). Наибольшее снижение обшей численности бактерий происходит в первые 10 суток от момента загрязнения. На дальнейших сроках наблюдается тенденция восстановления. Но, несмотря на наблюдаемую тенденцию, и на 120 сутки после загрязнения снижение численности бактерий составляет 23% от контроля (концентрация 1000 мг/кг

(р<0,01). При загрязнении чернозема тилозином в концентрации 10 мг/кг статистически достоверного изменения в численности бактерий не установлено.

Таблица 7

Динамика изменения общей численности бактерий чернозема при загрязнении антибиотиком тилозином, млрд/г

10 сутки

Контроль

10 мг/кг

100 мг/кг

1000 мг/кг

М±т

11,40±0,01

10.1 ±0,08

6,60±0,22**

3,90±0,05**

S

0,02

0,30

0,90

0,20

CV, %

0,31

3,38

13,46

0,21

% от контроля

89

58

35

60 сутки

М±т

11,72±0,14

10,59±0,11

8,63±0.17*

6,63±0,13**

S

0,50

0.40

0,70

0,50

CV, %

4,65

4,01

8,03

8,11

% от контроля

90

74

57

120 сутки

М±т

11,89±0,04

11,02±0,05

9,60±0,07*

9,12±0,12**

S

0,20

0,20

0,30

0,50

CV, %

1,31

1,67

2,95

5,12

% от контроля

93

81

77

Примечание. Достоверные отличия но отношению к контролю: *р<0.05; **р<0.01; ***р<0,001 при п=4.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >