Оптимизация условий микроклонального размножения Syringa vulgaris L. в Центральном ботаническом саду НАН Беларуси

Популярность сирени обыкновенной, наличие в коллекции высокодекоративных и сортов собственной селекции ставит задачу активного размножения ее для поддержания коллекции, создания обменного фонда и озеленения. Основанная вместе со становлением Центрального ботанического сада НАН Беларуси коллекция сирени в настоящее время включает много растений возраста выше 40-50 лет. Черенки от таких растений плохо укореняются и обладают слабым регенерационным потенциалом, что делает использование прививок и традиционного черенкования малоэффективным. В настоящее время проблема эффективного размножения и омоложения сирени может быть решена с помощью клонального микроразмножения. Создание таких технологий требует тщательного изучения особенностей культивирования различных сортов сирени in vitro.

В 80-х годах XX в. в основу работы была положена гипотеза об омоложении растений при длительном культивировании на питательных средах, содержащих цитокинины [292-294]. Как правило, если удается получить активно растущую и размножающуюся культуру от зрелого маточного растения, то такие растения имеют ювенильные морфологические и физиологические характеристики. На возможность омоложения при микроклонировании для сирени указывал ранее Pierik [295].

Оптимизация питательной среды.

Известно, что питательная среда MS не является оптимальной для микроклонирования сирени [296, 300]. Необходим подбор более подходящей по минеральному составу питательной среды, так как состав солей оказывает очень большое влияние на все этапы микроразмножения от его эффективности до жизнеспособности полученных растений при адаптации ex vitro.

Культивирование побегов сирени на разных питательных средах показало, что для всех исследованных сортов наиболее эффективное клонирование наблюдалось на среде MS (рис. 56). Однако эта среда способствовала развитию аномалий, которые выражались в виде скрученных вдоль центральной жилки листьев, а часто еще и в сильном удлинении междоузлий. Культивирование на средах WPM, В5 и SC, напротив, позволяло преодолеть развитие этих аномалий. Все эти среды отличали от среды MS как меньшая концентрация аммонийных ионов, так и меньшее содержание их относительно нитрат-ионов.

У большинства сортов наиболее близкие показатели коэффициентов размножения были получены на средах MS и В5. Только у сортов Радж Капур

Влияние различных питательных сред на коэффициент размножения ряда сортов сирени

Рис. 56. Влияние различных питательных сред на коэффициент размножения ряда сортов сирени: F. S. - Мадам Флорей Степман, Р. - Павлинка, F. - Флора, В. - Красавица Москвы, R. К. - Радж Капур, L. - Лаплас, М. - Лунный свет и Павлинка они различались достоверно. Для сорта Радж Капур эффективнее всего микроразмножение шло на среде MS, и ни одна другая используемая среда не давала таких результатов. Для сорта Павлинка культивирование побегов на среде MS было сравнимо с таковым на среде SC. При этом коэффициенты размножения на средах В5 и WPM были достоверно ниже таковых на двух других средах [296-298].

Высокая эффективность микроклонирования побегов на среде MS для всех изучаемых сортов стала причиной дальнейшей оптимизации питательной среды именно на ее основе. Дальнейшая работа планировалась с учетом данных Pierik et al. [299] и была дополнена вариантами сред с половинной дозой нитрата аммония, что снизило соотношение аммонийных ионов к нитратным.

Эксперимент позволил оценить влияние уменьшения относительной дозы ионов аммония в среде, с одной стороны, и увеличения общей концентрации макросолей - с другой, на микроразмножение исследуемых сортов сирени. В результате культивирования показатели коэффициента размножения и высоты побегов были достоверно ниже в контроле, чем на других средах (табл. 43).

Таблица 43. Влияние минерального состава питательной среды на микроразмножение сирени

Сорт

Среда

Коэффициент размножения

Длина побегов, мм

Случаи аномалий

Лунный свет

Контроль MS

3,5 ± 0,6

21,8 ±4,9

±±

1,5 MS

3,6 ± 0,7

15,4 ±3,8

MS модиф.

5,0 ± 0,5

46,9 ± 4,4

±

1,5 MS модиф.

4,8 ± 0,3

35,1 ±9,5

-

Нестерка

Контроль MS

4,2 ± 0,3

15,5 ±3,6

++

1,5 MS

5,2 ±0,5

28,7 ± 2,0

±

MS модиф.

5,1 ±0,3

24,3 ± 2,7

1,5 MS модиф.

5,5 ± 0,5

31,1 ±7,3

+

Примечание. «-» - без аномалий, «+» - менее 10% аномальных побегов, «++» - свыше 50% аномальных побегов.

В этом эксперименте при микроклонировании побегов также наблюдали сортовые различия. Для сорта Лунный свет более эффективное размножение наблюдали на модифицированных средах MS. Причем увеличение общей концентрации макросолей приводило к некоторому уменьшению высоты побегов, хотя эти различия и не были достоверными. Следовательно, для сорта Лунный свет целесообразно именно уменьшение в питательной среде аммонийного азота. Увеличение концентрации макросолей не привело к повышению коэффициента размножения, но несколько снизило активность роста, что нежелательно для техники микрочеренкования. Эффективность микроразмножения сорта Нестерка на всех средах, кроме MS, была одинакова. Для этого сорта оба использованных пути изменения минерального состава оказались важными.

Для исследуемых сортов сырой вес побегов, сформированных на модифицированной среде MS, был выше, чем на контрольной (табл. 44). Для сортов Красавица Москвы и Нестерка сухой вес побегов также был выше на модифицированной среде, но для сорта Лунный свет этот показатель достоверно не отличался от контроля.

Таблица 44. Сырой и сухой вес побегов сирени на средах разного минерального состава

Сорт

Среда

Сырой вес побега, мг

Сухой вес побега, мг

Лунный свет

MS MS модиф.

  • 156,0 ±0,5
  • 213,4 ±6,0
  • 27,2 ± 1,8
  • 32,4 ± 4,6

Нестерка

MS

MS модиф.

  • 127,7 ±3,4
  • 221,2 ±3,4
  • 21,8 ± 1,4
  • 34,3 ± 3,3

Красавица Москвы

MS

MS модиф.

  • 90,2 ± 4,7
  • 207,3 ± 8,9
  • 14.6 ± 0,2
  • 26.6 ± 2,2

Таким образом, для всех трех сортов оказалось целесообразным уменьшение в среде относительной дозы аммонийных ионов, что может оказаться важным и для микроразмножения других сортов сирени обыкновенной.

Одна из серьезных проблем культивирования сирени in vitro связана с частым развитием аномальных побегов. Среда MS имеет очень богатую композицию минеральных солей, что способствует эффективному микроклонированию сирени, но поддерживает развитие аномалий. Эту проблему можно решить с помощью оптимизации минерального состава среды. На наш взгляд, аномальное развитие связано с гипероводненностью побегов. Одной из причин этого может быть избыток аммонийных ионов. В ходе оптимизации питательной среды для культивирования сирени некоторые авторы приводят данные, что увеличение концентрации макросолей MS в 1,25-1,5 раза улучшает микроразмножение [299, 300]. Несколько позже такая модификация среды была успешно использована другими авторами [301, 302]. Наши эксперименты показали, что на эффективность микроразмножения сирени может оказывать существенное влияние не только количество аммонийного азота, но и соотношение в питательной среде аммонийных и нитратных ионов.

Изучено влияние цитокининов на микроклонирование сирени. На этапе микроразмножения наиболее важной группой регуляторов роста являются цитокинины [39, 40]. Из трех цитокининов (кинетин, БАИ, 2iP), действие которых мы анализировали, только БАП и 2iP оказались эффективными. Это согласуется и с другими работами по культивированию сирени in vitro [299, 301, 302, 306]. Дальнейшие исследования проводились с этими цитокининами.

Культивирование микрочеренков на средах с 1, 2 и 3 мг/л БАП в течение первого субкультивирования не показало достоверных различий в коэффициенте размножения для сортов Лунный свет и Нестерка. Только для сорта Павлинка наблюдалось повышение этого показателя с увеличением концентрации БАП, и различия между вариантами с 1 и 3 мг/л БАП были достоверны. Во втором субкультивировании тенденция к увеличению скорости размножения с возрастанием содержания в среде БАП проявилась у всех трех сортов. У сортов Нестерка и Павлинка различия в коэффициенте размножения между вариантами 1 и 3 мг/л БАП были достоверны, для сорта Лунный свет достоверных различий не отмечено.

Интересно, что у сортов Павлинка и Нестерка во втором субкультивировании коэффициенты размножения либо не отличались, либо были выше таковых в первом субкультивировании. Тот факт, что в течение двух субкультивирований не наблюдалось снижения скорости микроклонирования сирени, говорит о том, что концентрация 3 мг/л БАП невысока и нс будет приводить к накоплению аномалий развития. Некоторое снижение скорости размножения для сорта Лунный свет может быть связано с тем, что БАП не является оптимальным для этого сорта.

Сирень демонстрирует определенную толерантность как к типу, так и к концентрации цитокинина в питательной среде. Для выявления оптимального типа цитокинина для каждого сорта эксперимент был дополнен культивированием на средах с 2iP и средах с более высокими концентрациями обоих цитокининов. Результаты эксперимента показали, что БАП и 2iP в концентрации 5 мг/л вызывали активацию пазушных почек на еще растущем побеге, а у сорта Красавица Москвы сильно ингибировали их удлинение (табл. 45). Хотя для всех сортов отмечен высокий коэффициент размножения, а для сортов Флора и Лунный свет - наибольшая масса формирующихся побегов (табл. 45, 46), длительное использование таких доз регуляторов роста неизбежно приведет к накоплению аномалий развития. Следовательно, оптимальная концентрация цитокининов в питательной среде должна быть в пределах 1-3 мг/л.

Из приведенных в табл. 46 данных видно, что для сорта Нестерка БАП в концентрации 3 мг/л предпочтительнее, так как и коэффициент размножения, и длина, и масса побегов на этой среде у него достоверно выше, чем на среде с 1 мг/л 2iP. Концентрация БАП 1 мг/л недостаточна. Для сорта Красавица Москвы, напротив, по всем показателям видно преимущество культивирования на среде с 1мг/л 2iP.

Некоторое затруднение вызывает выявление оптимального типа цитокинина у сортов Флора и Лунный свет. Для них не обнаружено достоверных различий в коэффициенте размножения и длине побегов на средах с 3 мг/л БАП и 1 мг/л 2iP. Таким образом, несмотря на определенную толерантность сирени к типу цитокинина, следует заметить, что ряд сортов может иметь специфическую потребность либо в БАП, либо в 2iP.

Таблица 45. Влияние различных типов и концентраций цитокининов на эффективность роста и размножения сирени обыкновенной

Сорт

Тип и концентрация цитокининов

Коэффициент размножения

Длина побегов, мм

Флора

3 мг/л БАП

5,1 ± 0,2

66,4 ± 0,6

5 мг/л БАП

5,7 ± 0.2 *

55,2 ± 9,4

1 мг/л 2iP

5,5 ± 0,2

61,5 ±4,1

5 мг/л 2iP

6,5 ± 0,9 *

56,6 ±4,1

Красавица

3 мг/л БАП

6,5 ±0,1

47,9 ± 5,5

Москвы

1 мг/л 2iP

6,0 ± 0,2

75,1 ± 1,7

5 мг/л 2iP

6,8 ± 0,6 *

27,3 ± 1,9 **

Нестерка

1 мг/л БАП

4,6 ±0,1

22,2 ±3,8 **

3 мг/л БАП

5,3 ± 0,4

60,6 ± 1,8

1 мг/л 2iP

5,0 ± 0,3

36,0 ± 3,4

5 мг/л 2iP

6,3 ± 0,3 *

55,9 ± 1,9

Лунный свет

1 мг/л БАП

4,3 ± 0,5

52,6 ±4,3

3 мг/л БАП

5,1 ± 0,2

54,8 ±2,3

5 мг/л БАП

5,9 ±0,5 *

66.9 ± 5,9

1 мг/л 2iP

5,2 ± 0,3

60,8 ±3,1

5 мг/л 2iP

5,3 ± 0,3 *

61,1 ±4,6

  • * Активация пазушных почек.
  • ** Формирование сильно укороченных побегов.

Таблица 46. Влияние различных типов и концентраций цитокининов на массу формирующихся побегов сирени обыкновенной

Сорт

Тип и концентрация цитокининов

Сырая масса, мг

Сухая масса, мг

Флора

  • 3 мг/л БАП
  • 5 мг/л БАП *
  • 1 мг/л 2iP
  • 5 мг/л 2iP *
  • 145,7 ± 8,8
  • 141.9 ±47,7
  • 115.9 ± 13,6 154,5 ± 1,0
  • 26.6 ± 1,3
  • 25,4 ± 2,6
  • 22,2 ± 0,6
  • 24.7 ± 1,4

Красавица Москвы

  • 3 мг/л БАП
  • 1 мг/л 2iP
  • 5 мг/л 2iP *
  • 207,3 ± 8,9
  • 254,5 ± 4,0
  • 101,1 ±7,2
  • 26.6 ±2,2 41,2 ± 1,0
  • 12.7 ± 1,1

Нестерка

  • 3 мг/л БАП
  • 1 мг/л 2iP
  • 5 мг/л 2iP *
  • 221.2 ±3,4
  • 112,6 ± 15,4
  • 196.3 ± 18,6
  • 34,3 ± 3,3
  • 23,9 ±3,2 27,0 ± 3,0

Лунный свет

  • 3 мг/л БАП
  • 5 мг/л БАП *
  • 1 мг/л 2iP
  • 5 мг/л 2iP *
  • 213.6 ±6,0
  • 217.9 ± 1,6
  • 157.7 ±33,1
  • 236.9 ± 20,3
  • 31.1 ± 1,3
  • 30,3 ± 1,2
  • 27.1 ±4,3
  • 39,7 ± 1,1

* Активация пазушных почек.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >