Молекулярно-генетический анализ и паспортизация представителей ботанической коллекции рода Pinus

Важной задачей ботанических садов являются паспортизация и тестирование генофонда, которые имеют особенности, связанные с видоспецифич-ностыо биохимического состава. Первый этап работ - получение достаточно чистых препаратов суммарной ДНК, чему способствует выявление наиболее удобных тканей анализируемых растений. С этой целью были апробированы следующие части растений: молодые корешки, эндоспермы, проростки, почки, хвоя. Качество получаемых суммарных ДНК показал электрофоретический анализ, подтвердив в целом недеградированность препаратов, выделенных из различных органов сосны обыкновенной (рис. 12), наиболее удобными тканями для анализа оказались ткани хвои и почек.

Следующим этапом работ явилось использование выделенных препаратов ДНК для проведения RAPD анализа. Всего было использовано 84 образца 12 видов сосен (Р. репсе, Р. х schwerinii, Р. griffithii, Р. koraiensis, Р. pumila, Р. cembra, Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. nigra, Р. sylvestris, Р. contorta) и апробирован набор из 20 десятичленных праймеров. В ходе амплификации были выявлены 82 амплимерные зоны, 37 из которых оказались у исследованных деревьев полиморфными. Название праймеров, количество выявленных амплимерных зон и молекулярные массы продуцируемых ампликонов приведены в табл. 13.

Следует отметить, что в табл. 13 представлены только те амплимерные зоны, электрофоретическая идентификация которых была наглядна и легка, а генетическая детерминация не вызывала никаких сомнений. Обозначение зоны дано относительно размеров фрагментов маркера молекулярной массы.

Праймеры, дающие положительную амплификацию только с одним или несколькими видами, а также характеризующиеся артефактными результатами ПЦР анализа, были исключены из дальнейшего анализа (см. рис. 12).

Старт 1 234 5 6 789

Рис. 12. Электрофореграмма препаратов ДНК, выделенных из различных тканей сосны обыкновенной: 1,4, 7 - ткань эндоспермов; 2, 5, 8 - ткань хвои; 3, 6 - ткани почек;

9 - маркер молекулярной массы

Таблица 13. Характеристики протестированных праймеров

Праймер

Количество зон

Молекулярные массы, п. н.

Полиморфные зоны

Oligol

8

422, 453, 511, 710, 739, 784, 856,1015

422, 710, 739, 784, 856

Oligo2

3

673, 819, 1120

673

Oligo3

5

684, 725, 787,915, 1207

684, 787

Oligo4

3

985, 1368, 1820

1368, 1820

Oligo5

2

547, 781

781

Oligo6

5

421,698,754, 886, 967

698

Oligo7

3

568, 904, 1203

1203

Oligo8

7

412, 607, 654, 869, 1008, 1305, 1560

607, 1305

Oligo9

8

397, 504, 682, 876, 1140, 1367, 1765, 1912

682, 1140

OligolO

3

596, 846, 1127

596

Oligol 1

4

715, 917, 1156, 1749

917, 1156

Oligo 12

6

423,485,985, 1124, 1642, 1810

485, 1124

Oligol 3

2

746, 907

746, 907

Oligol4

3

298, 389, 785

289, 785

Oligol5

2

504, 862

862

Oligol7

2

251, 603

-

Oligol9

3

489, 1102, 1456

489

Oligo20

1

587

-

Oligo21

9

405, 453, 584, 601, 692, 801, 920, 982, 1764

453, 584, 801, 920, 982

Oligo22

3

265, 487, 863

-

В результате предварительного анализа 20 десятичленных праймеров для дальнейшего исследования были отобраны только 9 (представлены в табл. 14), выявляющие стабильные ГЩР спектры и позволяющие проводить сравнительный анализ видов сосен. RAPD анализ образцов ДНК 12 видов сосен с отобранными праймерами позволил выявить 41 RAPD зону (рис. 13-16).

Таблица 14. Структура праймеров для RAPD анализа и их характеристики

Праймер

5'—»3'

nN

Tm.°c

% GT

Oligo 6

CACGGCGAGT

10

34

70

Oligo 8

CGCCCCCATT

10

34

70

Oligo 9

AGGCCGCTTA

10

32

60

Oligo 11

TCCCGAACCG

10

34

70

Oligo 85

ATCGGTCGGTA

11

34

55

Oligo 91

CCGAACGGGT

10

34

70

Oligo 94

GGACGGGTGC

10

36

80

Oligo 98

GGGTAACGCC

10

34

70

Oligo 105

AATCGGGCTG

10

32

60

Примечание. 5' —> 3' — нуклеотидная последовательность праймера; nN - количество нуклеотидов; Тт - температура отжига праймера с учетом концентрации солей; % GT - процент G + Т оснований.

Электрофореграмма ГЩР-спсктра по праймеру Oligo8 (Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

Рис. 13. Электрофореграмма ГЩР-спсктра по праймеру Oligo8 (Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

Электрофореграмма ПЦР-спектра по праймеру Oligo91 (Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

Рис. 14. Электрофореграмма ПЦР-спектра по праймеру Oligo91 (Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

На основании полученных данных были составлены RAPD спектры (паспорта) исследованных видов сосен (табл. 15).

Как видно из структуры дендрограммы, изученные виды сосен разделились на два больших кластера, включающих виды пятихвойных (подрод Strobus'. Р. рейсе, Р. griffithii, Р. х schwerinii, Р. koraiensis, Р. sibirica, Р. strobus) и двуххвойных (подрод Pinus'. Р. mugo, Р. contorta) сосен, что соответствует современной систематике рода Pinus, основанной на изучении морфологических признаков.

Кластер подрода Strobus разделился на виды подсекции Strobi (Р. griffithii, Р. х schwerinii, Р. strobus) и подсекции Cembrae (Р. koraiensis, Р. sibirica).

Электрофореграмма ПЦР-спектра по праймеру Oligo98 (Р. рейсе, Р. griffithii, Р. *schwerinii (гибрид С-3), Р. koraiensis, Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

Рис. 15. Электрофореграмма ПЦР-спектра по праймеру Oligo98 (Р. рейсе, Р. griffithii, Р. *schwerinii (гибрид С-3), Р. koraiensis, Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

Электрофореграмма ПЦР-спектра по праймеру Oligo 105 (Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

Рис. 16. Электрофореграмма ПЦР-спектра по праймеру Oligo 105 (Р. sibirica, Р. strobus, Р. mugo, Р. contorta)

Данные RAPD анализа 12 видов сосен позволили с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 рассчитать коэффициенты Эвклидовой дистанции и, используя невзвешенный парно-групповой метод кластерного анализа (UPGMA), построить дендрограмму (рис. 17), иллюстрирующую степень генетической дифференциации среди изученных видов сосен.

Таблица 15. Паспорта 12 видов сосен коллекции ЦБС, построенные па основании данных RAPD-маркирования

Pinus рейсе Griseb.

Праймер

Ампликоны

01 igo6

Olg6590, Olg6I2()0

Oligo8

Olg8505, Olg8560, Olg8570, Olg81600, Olg8,800

Oligo9

O'g9ii00’ Olg9]3o0

OligoIl

-

Oligo85

Olg85290, Olg85700

Oligo91

Olg^hso’ Olg91630

Oligo94

Olg94950

Oligo98

Olg985!i0, Olg98700, Olg98||00, Olg981900

Oligol05

Olgl05320, Olgl05420, Olgl05520

Pinus x schwerinii

Oligo6

Olg6590, Olg6610, Olg6900, Olg6,200

Oligo8

Olg857o> Olg8|600, Olg81800

Oligo9

01ё9?оо> Olg9[ wo’ О1§91300

OligoIl

OlglI500’ Olgl l1300

Oligo85

Olg85700

Oligo91

Olg91350’ Olg91630

Oligo94

O!g9495o

Oligo98

Olg98580’ Olg98700, Olg98|000, Olg98l900

Oligol05

Olgl05320, Olgl05420, Olgl05480, Olgl05520

Pinus griffithii McClell. {Pinus wallichiana A. B. Jacks.)

Oligo6

Oligo6590, Oligo61000, Oligo6l200

Oligo8

Oligo8570> Oligo81600, Oligo81800

Oligo9

OHgo970o, Oligo9ll00, Oligo9l300

OligoIl

01igoll5()o,01igolli3oo

Oligo85

Oli85700

Oligo91

Oli91350

Oligo94

Oligo94950

Oligo98

Oligo98580, Oligo98700, Oligo981100, Oligo98|900, Oligol05320

Oligol05

Oligol05420, Oligol05520

Pinus koraiensis Siebold et Zucc.

Oligo6

Olg^470’ Olg6590, Olg6800, Olg6900

Oligo8

Olg857o> Olg81600, Olg8]800

Oligo9

Olg9?oo’ Olg9goo’ Olg9j2oo

OligoIl

OlgH|3oo

Oligo85

Olg85290, Olg85700

Pinus koraiensis Siebold et Zucc.

Праймер

Ампликоны

Oligo91

Olg91350

Oligo94

Olg94950

Oligo98

Olg98520, Olg98700, Olg981100, Olg98l900

Oligol05

Olgl05480, Olgl05520

Pinus pumila (Pall.) Regel (Pinus папа Lemee et H. Lev.)

Oligo6

Olg6470, Olg6590, Olg6800, Olg6900

Oligo8

Olg8570, Olg8|600, Olg8I800

Oligo9

Olg9g00, Olg91200

OligoIl

Olgl 11300

Oligo85

Olg85290, Olg85700

Oligo91

Olg91350

Oligo94

Olg94950

Oligo98

Olg98520, Olg98700, Olg981900

Oligol05

Olgl05480, Olgl05520

Pinus cembra L.

Oligo6

Olg^OQ’ Olg^cjoo

Oligo8

Olg857o, Olg81600, Olg81800

Oligo9

Olg^goo’ 01§912оо

OligoIl

Olg 111300

Oligo85

Olg85290, Olg85700

Oligo91

Olg9135o,

Oligo94

Olg94950

Oligo98

Olg98520,Olg98700,Olg98l900

Oligol05

Olgl05520

Pinus sibirica Du Tour

Oligo6

Olg6590, Olg6900, Olg61200

Oligo8

01gS57o, dg8i6oo> Olg81800

Oligo9

01g9goo’ Olg9120o

OligoIl

olgHi300

Oligo85

Olg85290, Olg85700

Oligo91

Olg91350

Oligo94

Olg94950

Oligo98

Olg9852o, Olg98700, Olg981900

Oligol05

Olgl05420, Olgl05520

Pinus strobus L.

Oligo6

Olg659o> Olg66l0, Olg6l200

Oligo8

Olg^sos’ Olg8560, Olg8570, Olg81600, Olg8lg00

Pinus strobus L.

Праймер

Ампликоны

Oligo9

Olg9no0, Olg91300

OligoIl

Olgl Ьзоо

Oligo85

Olg85290, Olg85700

Oligo91

Olg91j5o> Olg91630

Oligo94

Olg94950

Oligo98

Olg985g0, Olg98700, Olg981100, Olg981900

Oligol05

Olgl05320, Olgl05420, Olgl05520

Pinus mugo Turra

Oligo6

Olg6479, Olg6590, Olg6700, Olg6900, Olg6I200

Oligo8

Olg8495

Oligo9

Olg9goo, Olg91200, Olg9|300

OligoIl

-

Oligo85

-

Oligo91

Olg91350, Olg91470

Oligo94

°lg9415Oo

Oligo98

Ol§98600, Olg981000

Oligol05

Olgl054go

Pinus nigra J. F. Arnold

Oligo6

Olg647o, Olg659o> Olg6700, Olg6900, Olg61200

Oligo8

Olg8495

Oligo9

Olg^Boo

Oligoll

-

Oligo85

-

Oligo91

Olg91350,Olg91470

Oligo94

O1g94l500

Oligo98

Olg98600, Olg981000

Oligol05

Olgl054go

Pinus sylvestris L.

Oligo6

Olg6470, Olg6590, Olg6700, Olg6900, Olg6l200

Oligo8

Olg8495

Oligo9

Olg91200, Olg9l300

Oligoll

-

Oligo85

-

Oligo91

Olg91470

Oligo94

-

Окончание табл. 15

Pinus sylvestris L.

Праймер

Ампликоны

01 igo98

o|g98600> O1g981000

Oligol05

Olgl05480

Pinus contorta Douglas ex Loudon

Oligo6

Olg6590, Olg6800, Olg6900

Oligo8

-

Oligo9

01g9noo

OligoIl

-

Oligo85

-

Oligo91

dg91450> Olg91525

Oligo94

O1g941500

Oligo98

Olg98600> Olg98j 100

Oligol05

-

Интересными оказались результаты кластеризации видов подсекции Strobi (Р. griffithii, Р. х schwerinii, Р. strobus). Как известно, сосна Шверина не является самостоятельным видом, она гибрид между сосной гималайской (Р. wallichiana Jacks) и сосной Веймутова (Р. strobus L.). При этом сосна Гриффита - устаревшее название сосны гималайской. Поэтому результаты кластеризации (на основании ДНК маркеров) видов подсекции Strobi также абсолютно совпадают с систематикой рода Pinus, основанной на изучении морфологических признаков. При этом сосна Шверина (гибрид) имеет промежуточную генетическую структуру между сосной Веймутова и сосной Гриффита (сосной гималайской).

Дендрограмма, иллюстрирующая уровень генетической дифференциации изученных видов сосен, на основании анализа RAPD-локусов

Рис. 17. Дендрограмма, иллюстрирующая уровень генетической дифференциации изученных видов сосен, на основании анализа RAPD-локусов: 1 - Р. рейсе', 2 - Р. х schwerinii', 3 - Р. griffithii', 4 — Р. koraiensis; 5 - Р. pumila; 6- Р. cembra; 7 — Р. sibirica; 8 — Р. strobes', 9 - Р. mugo; К) - Р. nigra;

11 - Р. sylvestris; 12 -Р. Contort а

Низкая величина генетической дистанции между Р. strobus и Р. рейсе также согласуется с незначительными морфолого-анатомическими отличиями между данными видами.

Несмотря на объединение в один кластер сосны горной {Р. mugo), сосны черной (Р. nigra), сосны обыкновенной (Р. sylvestris) и сосны скрученной (Р. contorta) (данные виды входят в подрод Pinus), они не являются близкородственными, что также видно из величины дистанции - значительных генетических различий между группой (Р mugo, Р. nigra, Р. sylvestris) и Р contorta. Близкородственные виды Р. mugo, Р. nigra, Р. sylvestris характеризовались низким уровнем межвидовых различий.

В целом ДНК маркеры, и RAPD анализ в частности, представляют собой очень удобный, точный и информативный инструмент для всестороннего изучения растительного генома. И в случае сравнительного исследования таких таксономических единиц, как виды, на примере рода Pinus также были получены интересные в научном плане результаты.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >