Белковые маркеры

В настоящее время наиболее часто в качестве белковых маркеров используются изоферменты и запасные белки семян. Суть обеих методик заключается в электрофоретическом разделении определенной белковой фракции и сопоставлении состава этой фракции у сравниваемых организмов (таксонов) [16]. Биохимическое маркирование имеет ряд преимуществ: во-первых, является относительно простой методикой, во-вторых, анализ какой-либо белковой фракции дает, как правило, большое число маркеров; в-третьих, биохимические маркеры в большинстве случаев наследуются кодоминантно и в соответствии с законами Менделя. Однако есть у биохимических маркеров и свои недостатки. Главным из них является то, что само наличие маркера (определенного белка) зависит не только от наличия гена, кодирующего этот белок, но и от экспрессии этого гена. Это, в свою очередь, может определяться окружающими условиями.

Молекулярные маркеры на основе нуклеиновых кислот

Нуклеотидные вставки, делении, а также нуклеотидные замены определяют разнообразие аллелей большинства генов. В связи с этим главным объектом исследований генетики и прикладной ботаники становится разнообразие генетических ресурсов растений, выявляемое на уровне ДНК. Полиморфизм ДНК в масштабе целого генома можно изучать, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК (полное секвенирование геномов) или используя альтернативную технологию молекулярного маркирования. В основе этих методик лежат рестрикция эндонуклеазами, полимеразная цепная реакция (ПЦР) или секвенирование [16].

Исторически первым был предложен метод RFLP (restriction fragments length polymorphism, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) [42]. Суть его состоит в том, что анализируемая молекула ДНК или ее фрагмент подвергаются обработке одной или несколькими рестриктазами; получаемые фрагменты разделяются методом электрофореза, и каждый отдельный полученный фрагмент принимается за отдельный маркер. RFLP методом, в первую очередь, выявляются различия в нуклеотидной последовательности сайта рестрикции, а также в длине фрагмента между этими сайтами. Недостатками метода является относительно малое число получаемых маркеров и их некодоминантное наследование.

Вскоре после установления роли ДНК как хранителя генетической информации стала ясна перспективность использования данных о последовательностях нуклеотидов в ДНК для определения родственных связей между организмами. Уже к началу 1970-х годов были сформулированы, во многом советскими учеными, основные принципы геносистематики [25]. Однако исследования в этой области привлекли широкое внимание ботаников классического направления только в самом конце 1980 - начале 1990-х годов. Отношение ботаников к молекулярно-филогенетическим построениям было и во многом остается неоднозначным.

В годы бурного развития методов секвенирования ДНК в 1985 г. произошло еще одно чрезвычайно важное событие, за которое в 1993 г. Кари Маллис (Kary D. Mullis) получил Нобелевскую премию по химии. Им был разработан метод амплификации (многократного умножения) фрагментов ДНК с помощью так называемой полимеразной цепной реакции, или сокращенно ПЦР [43].

С момента появления ПЦР в метод вносили разнообразные изменения, были предложены различные разновидности, однако в основе этого разнообразия лежит уникальная возможность саморазмножения молекул ДНК, которая может воспроизводиться в системе in vitro с помощью ДНК полимеразы и мономерных блоков-нуклеотидов, которые данный фермент, «соблюдая» правила Чаргаффа, встраивает во вновь синтезируемую цепь ДНК. Однако механизм действия фермента таков, что он может начать синтез новой цепи по матрице из первой цепи только при условии наличия «затравки» - небольшого участка двуцепочечной ДНК, который формируется за счет происходящего по принципу комплементарности так называемого «отжига» специально приготовленного олигонуклеотида, или, иначе, праймера.

Основными компонентами ПЦР, в ходе которой амплифицируется определенный интересующий исследователя участок молекулы ДНК, являются, во-первых, сама исходная ДНК; во-вторых, избыточное количество специально подобранной пары олигонуклеотидных праймеров, ограничивающих выбранный участок ДНК; в-третьих, фермент термостабильная ДНК полимераза и, в-четвертых, «строительный материал» в виде смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов. Первым этапом каждого цикла является нагрев реакционной смеси до 94-96 °C, и он необходим для денатурации цепей ДНК (сначала исходных, а впоследствии и вновь синтезированных). Во время следующего этапа, проводимого обычно при температуре 50-60 °C, происходит отжиг олигонуклеотидных праймеров на одноцепочечной ДНК. Далее следует повышение температуры до оптимальной для проявления ферментативной активности используемой термостабильной ДНК полимеразы (обычно 72-75 °C), во время чего происходит образование иовых комплементарных цепей ДНК путем удлинения праймеров. Цикл на этом завершается. Для возобновления процесса и начала нового цикла необходимо, чтобы снова в реакционной смеси появились стартовые комплексы в виде одноцепочечных молекул ДНК с затравками, что достигается повторным кратковременным повышением температуры до тех же 95 °C и отжигом праймеров на денатурированной одноцепочечной ДНК, происходящим с понижением температуры. И так повторяется от 25 до 40 и более раз. Цепной же данная реакция названа потому, что продукты, наработанные ДНК полимеразой в ходе предыдущих циклов, используются в качестве матриц в последующих. Целевые двуцепочечные фрагменты ДНК, ограниченные с обеих сторон праймерами, впервые появляются только в третьем цикле и уже с четвертого начинается экспоненциальный рост их числа. В то же время с каждым новым циклом в цепную реакцию вовлекаются вновь синтезированные по гетерогенным матрицам целевые, пока еще одноцепочечные ампликоны, накопление которых уже затем в виде двуцепочечных продуктов происходит также экспоненциально. Так, например, несколько упрощенно можно подсчитать, что после 20 циклов количество целевых ампликонов теоретически превысит исходное количество мишеней в виде молекул ДНК более чем в миллион раз. После 30 циклов -в миллиард. Но это только теоретически. При этом одновременно в арифметической прогрессии увеличивается и число гетерогенных матриц, комплементарных цепям исходного фрагмента ДНК, однако таковые будут составлять ничтожную часть, которой, как правило, просто пренебрегают. Считается, что уже после 8-го цикла нецелевые продукты составляют менее 10%, а после 11-го цикла их число становится ниже 1%. Впрочем, процесс накопления продуктов в ходе ПЦР достаточно сложен, подчиняется своим внутренним законам, и итоговое количество амплифицированных фрагментов ДНК не совсем соответствует теоретически ожидаемому результату [44].

ПЦР развивается в двух направлениях: аналитическом и препаративном. Изначально ПЦР была предназначена для препаративного синтеза определенных фрагментов ДНК, синтезированные ампликоны предполагалось использовать для дальнейших молекулярно-биологических или генно-инженерных исследований. В дальнейшем оказалось, что благодаря высокой специфичности метода его можно использовать для анализа. Если подобрать пару праймеров таким образом, что она будет обеспечивать амплификацию только одного фрагмента ДНК, уникального для конкретного организма, то можно тестировать материал на присутствие-отсутствие этого организма в пробе, определять патогены растений, а также выявлять, из каких сырьевых ингредиентов были изготовлены продукты питания [45, 46].

После того как была предложена техника ПЦР, появилась возможность ее применения для выявления полиморфизма на уровне ДНК, и в разное время было разработано множество видов ПЦР-анализа - SSR (1989), STS (1989), SSCP (1989), RAPD (1990), SCAR (1993), CAPS (1993), 1SSR (1994), AFLP (1995), IRAP (2006) и др. (рис. 4). Эти методы различаются между собой по специфичности используемых праймеров и применению дополнительных подходов, в частности рестрикционного анализа [47].

Молекулярные маркеры

Монолокусные классы Мультилокусные классы

| CAPS

SNP

| РАгТ |

Блот-гибридизация

ПЦР

ДНК-чипы

Молекулярные методы исследования ДНК растений

Рис. 4. Молекулярные методы исследования ДНК растений

Для всех методик, в основе которых лежит ПЦР, характерна одна общая черта - для анализа достаточно очень небольшого количества ДНК, вплоть до нескольких нанограмм на реакцию. Это обстоятельство делает их более выгодными по сравнению с другими видами анализа, например с тем же RFLP. К методам, комбинирующим в себе ПЦР и рестрикцию, относятся CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) и AFLP (amplified fragments length polymorphism). AFLP - технически более сложный метод. Он заключается в селективной амплификации рестрикционных фрагментов [16].

Многие методики (RAPD, ISSR) не требуют предварительной информации о геноме. В большинстве случаев молекулярные маркеры, используемые для анализа внутривидового и межвидового разнообразия у растений (RFLP, RAPD, AFLP, SSR), представляют собой анонимные ДНК фрагменты, отражающие полиморфизм участков генома, выбранных случайным образом [46, 47]. Репрезентативное количество идентифицированных с их помощью полиморфных геномных локусов и относительная простота лабораторных процедур позволяют эффективно использовать эти маркеры при оценке геномного сходства близкородственных таксонов культивируемых видов и решении вопросов таксономии.

ПЦР предоставляет возможность не только определить, имеется ли данный фрагмент в пробе, но и оценить количество соответствующих сайтов в препарате нуклеиновых кислот. Наиболее широкое применение это нашло для оценки содержания определенных молекул РНК, что позволяет судить об экспрессии генов, кодирующих эти РНК. Для этого с помощью фермента РНК-зависимой ДНК полимеразы (обратная транскриптаза или ревертаза) на РНК матрицах синтезируют комплементарную, или первую, нить ДНК (кДНК), определенный фрагмент которой затем амплифицируют посредством ПЦР. Такое сопряжение обратной транскрипции и ПЦР называется ОТ-ПЦР. Если реакция отлажена должным образом, то по соотношению полученных ампликонов можно судить о соотношении количества определенных молекул РНК в биологических образцах [45].

Для целей прикладной генетики и селекции более эффективным является использование не только анонимных, но и функциональных молекулярных маркеров, которые идентифицируют полиморфизм в транскрибируемых кодирующих последовательностях ДНК - генах [45]. К методикам, которые опираются на знание о геноме, относятся, например, SCAR, EST и др. Они являются более надежными и воспроизводимыми, чем RAPD (random amplified polymorphic DNA) и ISSR (inter simple sequence repeats), но и требуют большего объема работы и больших материальных затрат. Базовым ресурсом для исследований функциональной геномики являются коллекции EST (Expressed Sequence Tags), представляющие собой секвенированные неполные копии генов, точнее фрагменты кодирующих последовательностей ДНК длиной 500-700 н. п. [48]. Создание коллекций EST обусловило также развитие чип-технологий, основной задачей которых является сравнительный мониторинг уровня генных транскриптов в экспериментальных образцах. Анализ экспрессии генов с использованием чин-технологий называют также транскриптомным анализом. По аналогии с геномом, подразумевающим совокупность всех генов организма, говоря о транскриптоме, имеют в виду совокупность всех генов, которые транскрибируются в данной ткани, на данном этапе развития организма. Потенциальное значение транскриптомного анализа для генетико-селекционных исследований очевидно: транскрипция генов является ключевым этапом для последующего белкового синтеза, поэтому изменения в гениой экспрессии могут непосредственно влиять на биохимические и физиологические процессы и, как следствие, отражаться на фенотипе.

Данная классификация отражает процесс «эволюции» ДНК маркеров. Первая из трех перечисленных выше групп представляет собой первое поколение ДНК маркеров, получивших широкое распространение в 1980-е годы. В 1990-е годы были разработаны ПЦР маркеры, в 2000-х годах началась эра молекулярных маркеров, основанных на использовании ДНК чипов. В последние 2-3 года для анализа полиморфизма ДНК все чаще используют метод прямого секвенирования генома или его отдельных участков. ДНК баркодирование, использующее секвенирование стандартных участков ДНК, особенно митохондрий и хлоропластов, все более широко используется для молекулярной систематики организмов [48]. Т. е. для разработки праймеров для некоторых анализов необходимо знание последовательности определенного участка генома. Такие сведения можно получить или из баз данных, или путем секвенирования соответствующих фрагментов ДНК.

В то же время, помимо непосредственного секвенирования полных геномов, все большее значение приобретает так называемая функциональная геномика, направленная на выяснение механизмов функционирования отдельных генов и их взаимодействия в составе целого организма. Именно в этом случае секвенирование геномов даст те сведения, которые от него ожидают, поскольку отдельные новые гены, которые становятся известны в результате «прочтения» какого-либо полного генома, могли бы быть клонированы и секве-нированы обычным путем и не представляют собой главную цель подобных проектов. Но учитывая огромный объем уже сейчас известной информации, в которой еще необходимо долго разбираться, можно представить, что пройдет довольно много времени, пока станет детально известен механизм слаженного функционирования всех генов хоть какого-нибудь относительно просто устроенного свободноживущего организма с небольшим геномом. Приближение к такому полному пониманию взаимодействия всего ансамбля генов лежит через постепенное выяснение основных принципов и особенностей функционирования геномов. Необходимым этапом служит обнаружение ш silico (т. е. в компьютере на уровне ДНК) всех потенциальных белковых продуктов, составляющих, по аналогии с геномом, так называемый протеом исследуемого организма, после чего необходимо определить функции этих еще гипотетических белков. Здесь надо отметить, что в настоящее время секвенирование ДНК является несравненно более производительным, чем определение последовательности аминокислот в белках, и поэтому последнее не носит массового характера и производится сейчас только в каких-то отдельных особых случаях.

Среди молекулярно-генетических маркеров, основанных на анализе нуклеиновых кислот, нельзя выделить наиболее приемлемые, так как каждый из методов имеет как свои преимущества, так и свои недостатки. Об этом говорит даже сам факт наличия такого множества применяемых на практике методик. Самые популярные и широко используемые методы при работе с растениями - RFLP, RAPD, ISSR, SSR и др. [47, 48]. Эти методы представляют генетические маркеры, позволяющие анализировать растения на уровне ДНК. К ним применимы термины классической генетики, такие, как «локус», «аллель», «доминантный и кодоминантный тип наследования». Аллели маркерных локусов представляют собой различные формы (нуклеотидные последовательности, отличающиеся по длине и/или по нуклеотидным заменам) одного и того же маркера, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом. Если метод анализа маркера позволяет выявлять оба аллеля, то говорят о кодоминантном типе наследования данного маркера, если выявляется только один аллель - о доминантном наследовании. Молекулярные маркеры подразделяют на монолокусные и мультилокусные (см. рис. 4). Монолокус -ные маркеры наследуются чаще всего по кодоминантному типу, мультилокусные - по доминантному.

Классификация ДНК маркеров осуществляется на основании различных критериев [46-48]:

  • 1) по уровню изменчивости (мономорфиость, гипервариабелыюсть) маркер должен обладать высокополиморфной природой для оценки генетического разнообразия;
  • 2) по характеру наследования (доминантный, кодоминантный), что позволяет определять гомозиготное и гетерозиготное состояние диплоидного организма;
  • 3) по механизму передачи (обоеполое наследование, наследование только по материнской или отцовской линии);
  • 4) по локализации в геноме (ядерная ДНК, хлоропластная ДНК и др.), кроме того, маркер должен быть равномерно и часто распределен по геному;
  • 5) обладать селективной нейтральностью: последовательности ДНК любого организма нейтральны по отношению к условиям окружающей среды и применяемым методам;
  • 6) надежность и доступность при получении (легко, быстро и дешево) и оценке;
  • 7) обладать высокой воспроизводимостью; позволять легкий обмен данными между лабораториями.

Для количественной оценки генетической изменчивости на меж- и внутривидовом уровне с помощью методов, основанных на использовании моле кулярных маркеров, были разработаны различные показатели генетического полиморфизма и дифференциации: доля полиморфных генов, количество аллелей на локус, эффективное число аллелей, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность, генетическое разнообразие Неи, популяционная подразделенность Райта и Линча, генетическая дистанция Неи и др. [22, 46, 48]. На выбор ДНК маркеров подходящего типа для решения конкретной задачи также влияет возможность автоматизации процесса.

В связи с тем что каждый из методов имеет свои недостатки, эффективным и широко применяемым подходом является совместное применение нескольких различных методов выявления генетического разнообразия [42-48]. При этом совместно могут использоваться принципиально различные подходы (например, сравнение морфологических признаков совместно с какой-либо из молекулярно-генетических методик или различные молекулярные методы, например RAPD и ISSR). При совместном использовании двух и более молекулярно-генетических подходов данные, полученные с их помощью, могут как сходиться, так и существенно различаться.

В целом молекулярные маркеры на основе нуклеиновых кислот широко используются для документирования генетических ресурсов и решения следующих вопросов:

оценки генетического разнообразия популяций, коллекций и т. п., когда проводят генотипирование или генетическую паспортизацию особей или форм, составляющих популяцию, коллекцию либо иную группу. Это означает, что для каждой особи или формы проверяют наличие либо характер проявления у нее множества молекулярно-генетических маркеров. В конечном счете количество анализируемых локусов должно быть настолько велико, чтобы по ним можно было отличить любые особи или формы в коллекции (популяции);

обнаружения межвидовых различий, когда виды трудно идентифицировать морфологически;

оценки фактического размера популяции (Ne), ключевого показателя для определения степени уязвимости популяции, особенно когда трудно получить такую информацию, как генеалогия, данные по учету численности и т. п. (например, в отношении диких популяций);

изучения дрейфа генов между интродуцентами и их дикими родственниками;

оценки генетической отдаленности в целях выявления диких популяций, изучения предполагаемых центров происхождения (например, теосинте как предка кукурузы);

построения молекулярных карт отдельных хромосом и геномов, картирования на них генов и локусов количественных признаков (QTL).

Перечисленное свидетельствует, что в настоящее время область применения молекулярных маркеров в ботанических, генетических и селекционных исследованиях весьма значительна.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >