Примеры индивидуального анализа целостности и стабильности генома лимфоцитов периферической крови в различных группах риска

Чтобы продемонстрировать, как работает предложенный алгоритм диагностики геномной нестабильности у отдельного индивида, приведем несколько примеров.

Обследуемые А и Б - пациенты РНПЦ «Мать и дитя» с предполагаемым диагнозом «синдром хромосомной нестабильности» (СХН) и множественными врожденными пороками развития. В первом случае совокупность определенных клинических признаков и данные выполненного цитогенетического анализа позволили установить диагноз анемии Фанкони. Во втором случае с помощью FISH-метода обнаружена микроделеция 7ql 1.23, характерная для синдрома Вильямса-Бойрена. Образцы крови обоих пациентов дополнительно проанализированы с помощью метода ДНК-комет для определения уровней эндогенных повреждений ДНК, повреждений, индуцированных пероксидом водорода, кинетики и эффективности репарации ДНК за период 3-часовой инкубации обработанных лимфоцитов при 37 °C. Результаты, представленные в табл. 4.8 и на рис. 4.6, позволили сделать следующие заключения.

Таблица 4.8. Результаты анализа целостности генома лимфоцитов периферической крови у пациентов А и Б

Пациент/изучаемый параметр

Эмпирические значения по сравнению с референтными интервалами в точках фиксации клеток

0 мин

30 мин

60 мин

180 мин

Обследуемый А

-

-

-

26

Обследуемый Б

35

Фоновый уровень повреждений ДНК, а. и. (референтные интервалы)

-

-

-

2-15

Обследуемый А

164

58

36

24

Обследуемый Б

107

72

58

31

Индуцированный уровень повреждений ДНК, а. и. (референтные интервалы)

52-110

10-47

7-32

4-25

Обследуемый А

-

65

78

85

Обследуемый Б

-

33

46

71

Эффективность репарации ДНК (ЭР), % (референтные интервалы)

-

48-84

60-89

70-94

Примечание. Жирным шрифтом выделены эмпирические значения изучаемых показателей.

У первого пациента (А) обнаружены следующие признаки геномной нестабильности-, уровень эндогенных повреждений в 3,7 раза превышает этот показатель в референтной выборке здорового населения Беларуси и выходит за пределы интервала нормы. Частота индуцированных повреждений ДНК на 0, 30, 60-й мин по-

О 30 60 90 120 150 180

Время (мин)

Рис. 4.6. Кинетика репарации ДНК в лимфоцитах пациентов А и Б по сравнению с нормальным репарационным процессом

еле мутагенного воздействия выше, чем у здоровых лиц, и также превосходит верхнюю границу референтных интервалов. Показатели ЭР в пределах нормы. Проведенное исследование показывает, что данный пациент отличается высокой чувствительностью клеток к окислительному стрессу, что свойственно для анемии Фанкони.

У второго пациента (Б) обнаружены следующие признаки геномной нестабильности’, уровень эндогенных повреждений в 5 раз превышает этот показатель в выборке здорового населения Беларуси и выходит за пределы референтного интервала. Частота индуцированных повреждений ДНК на 30, 60 и 180-й мин после мутагенного воздействия превышает соответствующие интервалы нормы. Кинетика репарации ДНК свидетельствует о замедлении этого процесса. Показатели ЭР во всех точках меньше, чем у здорового населения, а в течение первого часа исследования выходят за нижние границы референтного интервала. Следовательно, данный пациент отличается повышенной чувствительностью клеток к дополнительному мутагенному воздействию за счет снижения скорости и эффективности репарации ДНК, что может быть обусловлено утратой ассоциированных с микроделецией генов, контролирующих клеточный ответ на повреждения ДНК.

Обследуемые В и Г - работники промышленного предприятия, включенные в исследование после подписания информированного согласия. В образцах крови определены спонтанная и индуцированная гибель лимфоцитов; уровень фоновых и индуцированных повреждений ДНК; эффективность процесса репарации ДНК за 3-часовой период инкубации клеток, обработанных in vitro Н2О2. Результаты, представленные в табл. 4.9, показывают, что у донора В все количественные показатели не выходят за пределы интервалов нормы, свойственных здоровым представителям населения Беларуси, и характеризуют состояние генома лимфоцитов как стабильное.

У донора Г обнаружены следующие признаки аномального ответа лимфоцитов на повреждения ДНК: частота индуцированных повреждений ДНК на 0, 30, 60-й мин после мутагенного воздействия больше, чем у здоровых лиц, и превышает соответствующие интервалы нормы. Показатели ЭР на 30 и 60-й мин анализа не соответствуют референтным интервалам. Результаты анализа показывают, что ответ лимфоцитов на дополнительное мутагенное воздействие отличается от нормы, возможно, за счет задержки репарации ДНК в течение первого часа инкубации клеток, затем все показатели нормализуются.

Таблица 4.9. Результаты индивидуального анализа целостности генома в лимфоцитах периферической крови у доноров В и Г

Донор / изучаемый параметр

Эмпирические значения по сравнению с референтными интервалами в точках фиксации клеток

0 мин

30 мин

60 мин

180 мин

Обследуемый В

7

Обследуемый Г

3

Фоновый уровень повреждений ДНК, а. и. (референтные интервалы)

-

-

-

2-15

Обследуемый В

84

29

10

8

Обследуемый Г

129

86

53

4

Индуцированный уровень повреждений ДНК, а. и. (референтные интервалы)

52-110

10-47

7-32

4-25

Обследуемый В

65

88

90

Обследуемый Г

33

59

97

Эффективность репарации ДНК (ЭР), % (референтные интервалы)

-

48-84

60-89

70-94

Примечание. Жирным шрифтом выделены эмпирические значения изучаемых показателей.

Приведенные примеры демонстрируют эффективность предложенной технологии в выявлении аномального ответа клеток на повреждения ДНК. В случае подозрения на СХН или синдромы микроделеций она служит хорошим дополнением к методам цитогенетического обследования пациентов, обладая при этом большой информативностью и позволяя внести ясность в понимание механизмов геномной нестабильности при конкретном заболевании. В группах населения, контактирующего с загрязнителями среды, описанный алгоритм исследования целостности генома дает возможность обнаружить лица с повышенной чувствительностью лимфоцитов к повреждениям ДНК. Из данных также следует, что аномальный клеточный ответ на повреждения ДНК (увеличенные уровни фоновых и индуцированных повреждений ДНК, пониженная репарационная способность) служит биомаркером скрытой (или развивающейся) геномной нестабильности, возможно, ассоциированной с предрасположенностью к воспалительным и другим соматическим заболеваниям.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >