Оценка целостности генома лимфоцитов у пациентов с МВПР

Диагноз МВПР ставился на основании клинической симптоматики. В эту группу вошли пациенты с врожденными пороками сердца, черепно-лицевыми дисморфиями, задержкой физического и психомоторного развития и др. В группе, насчитывающей 50 человек, выделено 16 пациентов с клинически предполагаемым диагнозом синдромов микроделеций: 7ql 1.23 (12 человек) и 22ql 1.2 (4 пациента).

У всех пациентов проводили цитогенетический анализ культивируемых лимфоцитов периферической крови, включающий: 1) стандартный анализ кариотипа (GTG-метод); 2) анализ частоты и спектра спонтанных неспецифических аберраций хромосом; 3) FISH-диагностику с использованием локус-специфических проб на наличие микроделеций 7ql 1.23 и 22qll.2 для подтверждения диагноза соответствующих синдромов. Процедура кариотипи-рования не обнаружила изменений кариотипа у обследованных пациентов. Обобщенные результаты цитогенетического анализа представлены в табл. 3.1 и на рис. 3.5.

Частота аберраций хромосом

Рис. 3.5. Частота аберраций хромосом (АХ) у пациентов с синдромами микроделеций и МВПР по сравнению с контролем. К - контроль; СВБ - синдром Вильямса-Бойрена; МВПР - множественные врожденные пороки развития; дел - синдром микроделеции в 22-й хромосоме

На фоне достаточно большого размаха данных, особенно выраженного у пациентов с МВПР, установлено некоторое увеличение средних частот аберраций хромосом в этой группе и при синдроме Вильямса-Бойрена, в отличие от группы пациентов с микроде-лецией 22ql 1.2, в которой только у одного ребенка зарегистрировано 14 % аберрантных клеток. В остальных случаях индивидуальные значения цитогенетических показателей не выходили за пределы вариабельности, характерной для здорового населения Беларуси [Гончарова и др., 2008; Савина и др., 2009; Savina et al., 2011]. Анализ спектра аберраций также не выявил существенных отличий от нормы.

Параллельно проводился анализ состояния генома лимфоцитов с помощью метода ДНК-комет. Данные представлены в табл. 3.4 и на рис. 3.6.

Таблица 3.4. Ответ лимфоцитов на повреждения ДНК в группах пациентов с синдромами микроделеций и МВПР

Показатель

Время фиксации, мин

Контроль

Пациенты

СВБ

del 22qll,2

МВПР

Эндогенные повреждения ДНК (а. и.)

180

9,13±0,79

28,20±4,62*

6,00±1,00

20,95±2,22*

Н,Оэ-индуциро-ванные повреж-дения ДНК, (а. и.)

0

85,63±4,38

104,88±4,38*

91,50±23,95

119,67±11,40*

30

31,69±3,19

60,0±8,62*

43,50±24,83

52,89±6,58

60

22,69±2,05

54,13=5,41*

47,25±23,35

50,22±7,04

180

13,32±1,07

48,86±9,36*

34,50±19,50

26,50±3,82*

Эффективность репарации ДНК(%)

30

64,13±2,60

51,13±5,59*

59,36±12,29

55,90±3,08

180

83,19±1,45

53,89±9,56*

42,50±25,58

74,97±4,74

* Достоверные различия между группой пациентов и контролем при р < 0,05.

При использовании этого подхода у пациентов с СВБ признаки геномной нестабильности четко проявились по всем показателям (р = 0,002 для эндогенных повреждений; р = 0,05, 0,0124, 0,0004 и 0,0066 для указанных точек фиксации после обработки лимфоцитов пероксидом водорода) [Savina et al., 2011].

Уровни эндогенных

Рис. 3.6. Уровни эндогенных (а) и остаточных повреждений ДНК после окислительного стресса (б) в лимфоцитах у пациентов с синдромом Вильямса-Бой-рена и МВПР по сравнению с контролем (оба показателя измерялись на 180-й мин инкубации лимфоцитов in vitro)

Различия, наиболее существенные для эндогенных и остаточных экзогенных повреждений ДНК, отмечены также при МВПР (рис. 3.6 а и 3.6 б, соответственно). Видно, что данные показатели значительно превышают контрольные значения. Следовательно, результаты свидетельствуют о дестабилизации генома, которая, по крайней мере, при СВБ обусловлена нарушением процесса репарации ДНК, о чем свидетельствуют высокий уровень остаточных повреждений ДНК и пониженная эффективность репарации ДНК к концу инкубации обработанных лимфоцитов. У пациентов с микроделецией в 22-й хромосоме наблюдаемые тенденции к повышению уровня повреждений ДНК статистически не доказаны из-за большой вариабельности данных. Возможно, увеличение выборки могло бы дать более определенные результаты.

Отметим, что при синдроме Вильямса-Бойрена модификация клеточного ответа на эндогенные и экзогенные повреждения ДНК наблюдалась не только по отношению к здоровым донорам, но и к пациентам с некоторыми клиническими проявлениями данного синдрома, в лимфоцитах которых не удалось обнаружить соответствующую микроделецию (табл. 3.5). Повышенный уровень повреждений ДНК, ассоциированный с микроделецией 7qll.23, сочетался с уменьшением скорости и эффективности репарации ДНК, что позволило связать аномальный клеточный ответ на повреждения ДНК с утратой определенных генов в пределах этой делеции [Savina et al., 2011].

На рис. 3.7 представлена кинетика и эффективность репарации ДНК в лимфоцитах крови после их обработки Н?О, in vitro у пациентов с МВПР, синдромами микроделеций в 7-й (СВБ) и 22-й хромосомах по сравнению с контрольной группой здоровых доноров.

Таблица 3.5. Цитогенетическая характеристика и ответ на повреждения ДНК FISH-негативных и FISH-позитивных лимфоцитов у пациентов с пороками сердечно-сосудистой системы и клинически предполагаемым диагнозом СВБ

FISH-тест (7qll.23)

п

Метафазы («)

Частота аберрантных клеток(%)

Тип аберраций, %

Уровни повреждений ДНК, а. и.

хромосомный

хроматидный

Эндогенный (180 мин)

Н,О,-индуцированный

начальный (0 мин)

остаточный (180 мин)

-

6

600

3,67± 0,56

0,83± 0,17

2,83± 0,48

  • 15,33±
  • 3,57

Н2,0± 1 2,68

23,0± 7,02

+

12

1300

3,83± 0,37

0,96± 0,28

2,88± 0,26

28,20± 4,62'

  • 104,88±
  • 9,29
  • 48,86±
  • 9,362

Примечание. Существенные различия согласно двухстороннему /-тесту между клетками с выявленной микроделецией (FISH+) и лимфоцитами, в которых не удалось обнаружить микроделецию (FISH-), по эндогенному уровню повреждений ДНК ('/> = 0,045) и остаточному уровню 11,0,-индуцированных повреждений ДНК (2р = 0,05).

  • --?--ЭР-СВ —А—ЭР-К
  • —3P-dcl22 —•—ЭР-МВПР

Рис. 3.7. Кинетика (а) и эффективность (б) репарации ДНК в лимфоцитах после их обработки пероксидом водорода in vitro у пациентов с синдромами микроде-леций и МВПР: Del-22 - делеция в 22-й хромосоме; Контроль - группа здоровых доноров; СВ - пациенты с синдромом Вильямса-Бойрена; МВПР - пациенты с множественными врожденными пороками развития

Кинетика элиминации индуцированных повреждений ДНК (рис. 3.7, а) в течение 3-часовой инкубации клеток после окислительного стресса во всех представленных группах описывается уравнением степенной зависимости. Видно, что репарация ДНК у пациентов замедлена по сравнению со здоровыми индивидами в контроле. Однако наиболее существенные отличия от нормального репарационного процесса найдены в лимфоцитах пациентов с СВБ. Представление результатов анализа в логарифмической системе координат [Savina et al., 2011] позволило сравнить коэффициенты линейной регрессии, которые более чем в 2 раза (/? < 0,01) различаются в группах пациентов с СВБ (р = -0,16) и здоровых доноров (р = -0,36), указывая на существенные отличия углов наклона регрессионных прямых, отвечающих эмпирическим данным в этих группах, что, в свою очередь, свидетельствует о снижении скорости репарации ДНК при этом заболевании по сравнению с контролем. Рис. 3.7, б наглядно демонстрирует уменьшение эффективности репарации ДНК в лимфоцитах пациентов, особенно при наличии микроделеций в 7-й и 22-й хромосомах, относительно этого показателя в контрольной группе. Нарушение репарации ДНК становится наиболее явным к концу инкубации лимфоцитов.

Таким образом, с помощью метода ДНК-комет выявлены тенденции к дестабилизации генома лимфоцитов во всех обследованных группах пациентов с пороками развития, но наиболее существенные и стабильные отличия от контроля наблюдались при синдроме Вилъямса-Бойрена.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >