НАСЛЕДСТВЕННАЯ ПАТОЛОГИЯ, АССОЦИИРОВАННАЯ С НАРУШЕНИЯМИ РЕПАРАЦИИ ДНК

Согласно электронному словарю «The Medical Subject Headings (MeSH)» [http://www.nlm.nih.gov/mesh/] Национальной медицинской библиотеки при Национальном институте здоровья США, «геномная нестабильность» определяется как «увеличенная склонность генома приобретать мутации вследствие нарушений (дисфункций) различных процессов, вовлеченных в репликацию и поддержание генома» (Genomic instability - an increased tendency of the genome to acquire mutations when various processes involved in maintaining and replicating the genome are dysfunctional). Причины возникших дисфункций могут иметь экзогенное и эндогенное происхождение. В число эндогенных входит мутационная изменчивость генов, нарушающая репарационные функции клеток. Ярким примером причинно-следственной связи дефектов систем репарации ДНК, дестабилизации клеточного генома и патологии служат наследственные синдромы хромосомной нестабильности у человека. Для лучшего понимания этиологии и патогенеза этих болезней кратко охарактеризуем репарационный процесс.

Системы и функции репарации ДНК (краткий обзор)

Опознание повреждений ДНК

Первичные повреждения ДНК узнаются специализированными ферментами - ДНК-гликозилазами, среди которых АР-лиазофор-мамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (FPG) известна также как 8-оксигуанин-ДНК-гликозилаза или протеин MutM [Lloyd, Van Houten, 1995]. Энзим узнает и инициирует репарацию на сайтах, модифицированных под влиянием АФК. Весь цикл обработки этих повреждений включает сканирование ДНК, локализацию специфического субстрата, расщепление гликозидной связи, расщепление фосфодиэфирной связи путем 0-элиминации и другие этапы, и все они осуществляются FPG-протеином [Tchou, Grollman, 1993]. К достаточно хорошо изученным ферментам относится и эндонуклеаза III Е. coli. Более точное ее название - ДНК-гликозилаза/ АР-лиаза. В отличие от предыдущего фермента, эта нуклеаза обладает широкой субстрат-специфичностью: узнает cis- и trans-тимин-гликоли, дигидротимин, 6-гидрокси-5,6-дигидротимин, цитозил- и урацилгидраты, 5-гидрокси-5-метилгидантоин, мочевину [Lloyd, Van Houten, 1995]. Показано, что связыванию с ДНК способствует несколько аминокислотных остатков [Cunningham et al., 1994; Kuo et al., 1992], в частности К-120, известный еще как рецептор нуклеофильных атак [Lloyd, Van Houten, 1995].

Роль ферментов, которые узнают и инициируют репарацию аддуктов алкилирования ДНК, выполняют N-метилпурин ДНК-гликозилазы. У Е. coli обнаружены два значимых энзима с такими функциями: 3-метиладенин-ДНК-гликозилаза I и II (продукты генов tag и alkA, соответственно) [Lloyd, Van Houten, 1995]. Продукт гена tag проявляет строгую специфичность по отношению к 3-метиладенину, тогда как продукт гена alkA катализирует освобождение не только этого аддукта, но и 3-метилгуанина, 7-метил-гуанина, О2-метилтимина, О2-метилцитозина. Специфическими субстратами фермента 3-метиладенин-ДНК-гликозилазы II являются ЬР,3-этано- и этеногуанины [Habraken et al., 1991; Matijasevic et al., 1992]. Кроме того, функциональный гомолог, выделенный из клеток человека, удаляет 1,1Ч6-этеногуанин [Singer et al., 1992] и все циклические этено-аддукты [Dosanjh et al., 1994], при этом последние освобождаются в 10 раз быстрее, чем 3-метиладенин.

Опознание в системе эксцизионной репарации ДНК выполняется АТФ-зависимым мультипротеиновым комплексом [Lloyd, Van Houten, 1995]. У Е. coli эта система функционирует под управлением трех генов: uvrA, uvrB и uvrC. Роль узнающего комплекса принадлежит продукту UvrA2B, который, используя энергию гидролиза АТФ, может двигаться вдоль ДНК, отыскивая конфор мационные изменения. Еще до обнаружения мишени в ДНК-про-теиновом комплексе возникают аллостерические изменения, которые влияют на сродство UvrA2 к сайту повреждения. Последующая диссоциация этого белка стабилизирует комплекс UvrB-ДНК и способствует его связыванию с UvrC. Аллостерические изменения в продукте UvrB активизируют нуклеазу, которая расщепляет фосфатный остов за 4 нуклеотида с 3’-стороны от поврежденного основания. Эта реакция в свою очередь служит сигналом для подключения UvrC-нуклеазы, которая гидролизует фосфо-диэфирную связь с 5’-конца за 7 нуклеотидов от повреждения. Затем в результате действия ДНК-геликазы II и ДНК-полимеразы постинцизионный комплекс UvrBC-ДНК распадается, и образовавшаяся брешь заполняется «заплатой», размером в 12 нуклеотидов. В клетках млекопитающих нить разрезается за 22-23 нуклеотида с 5’-стороны и 5 нуклеотидов с 3’-стороны от поврежденного сайта [Huang et al., 1992], что хорошо согласуется с размером репарационной «заплаты», оцененной в 25-30 нуклеотидов [Shivji et al., 1992]. Образование комплекса UvrA2B с ДНК является фундаментальным для всех про- и эукариотических организмов, включая человека.

Теперь уже ясно, что узнавание повреждений зависит от конформации ДНК, которая может оказывать общее или местное влияние. Например, система UvrABC разрезает плазмидную ДНК, содержащую поперечные сшивки, индуцированные псораленом или митомицином С, в 100 раз эффективнее, если ДНК суперспи-рализована [Pu et al., 1989; Munn, Rupp, 1991]. Обнаружен также эффект нуклеотидных последовательностей. Так, при репарации индуцированных псораленом сшивок ДНК на участках, насыщенных гуанином, разрезание ДНК задерживается [Svoboda et al., 1993; Ramaswamy, Yeung, 1994].

Продукты генов uvrABC обрабатывают широкий спектр субстратов. Об этом свидетельствует высокая чувствительность дефектных по соответствующей системе бактерий, к летальному действию многих повреждающих агентов, в числе которых N-аце-токси-2-ацетиламинофлуорен, диоловые эпоксиды бензпирена, митомицин С, азотистый иприт. В равной степени это относится к таким аддуктам, как апуриновые и апиридиновые сайты, пиримидиновые димеры, тимин-гликоль и проч. [Lloyd, Van Houten, 1995]. Такую же чувствительность проявляют клетки от больных пигментной ксеродермой.

Таким образом, репарация запускается определенными белками, узнающими первичные повреждения или вызванные ими конформационные изменения ДНК. Опознание первичных повреждений ДНК наиболее изучено и во многом понятно в системе эксцизионной репарации у Е. coli. У бактерий, дрожжей, млекопитающих и человека обнаружены гомологичные белки, что позволяет судить об общности происходящих процессов у про- и эукариот. К ферментам с такими функциями относятся специализированные ДНК-гликозилазы, узнающие оксигенные модификации, алкилированные основания, определенные фотопродукты и некоторые другие аддукты ДНК.

Сравнительно недавно предложена модель двухэтапного узнавания повреждений ДНК у млекопитающих [Sugasawa et al., 2009], которая представлена на рис. 2.1. Схема иллюстрирует роль в этом процессе ДНК геликаз - ферментов, осуществляющих раскручивание нитей ДНК, и предусматривает следующие шаги: ХРС (Xeroderma pigmentosum группы С - протеин, чувствительный к повреждениям) внедряется во внешнюю петлю на нижней нити ДНК, что позволяет загрузить TEIIF комплекс с 5’-стороны верхней нити и осуществить перенос XPD-геликазы в 5’—>3’ направлении. Блокирование продвижения XPD-геликазы аберрантной структурой указывает на присутствие повреждения и приводит к сборке преинцизионного комплекса. В процессе узнавания повреждений ДНК участвуют также другие ассоциированные с пигментной ксеродермой протеины. ХРВ-АТРаза необходима для первоначального раскрытия дуплекса ДНК, что способствует связыванию XPD с ДНК и инициирует перемещение протеина. ХРА может играть роль в стимулировании геликазной активности XPD и/или узнавании химических модификаций в дополнении к другим факторам эксцизионной репарации нуклеотидов (TFIIH, ERCC1-XPF, RPA).

Процесс узнавания повреждений ДНК в эксцизионной репарации ДНК у млекопитающих

Рис. 2.1. Процесс узнавания повреждений ДНК в эксцизионной репарации ДНК у млекопитающих (адаптировано из [Sugasawa et al., 2009]). Модель двухэтапного узнавания повреждений при эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) у млекопитающих (а). ХРС (Xeroderma pigmentosum группы С) - протеин, чувствительный к повреждениям. TFI1H - транскрипционный фактор человека, состоящий из семи субъединиц, образующих базальный комплекс. Коровые субъединицы ERCC2/XPD и ERCC3/XPB имеют геликазную и АТР-азную активности. Другие субъединицы, CDK7 и циклин Н, фосфорилируют серин в С-тер-минальном домене РНК-полимсразы II. Выполняя жизненно важные функции в транскрипции, TFIIH комплекс вовлечен также в репарацию ДНК. ERCC1-XPF комплекс обладает эндонуклеазной активностью и участвует в различных путях репарации ДНК. RPA - репликационный протеин А - связывается с од-нонитевой ДНК, препятствуя ее обратному скручиванию. Модель, экстраполированная на процесс глобальной репарации нуклеотидов (б)

При экстраполяции этой модели на обычный процесс глобальной репарации нуклеотидов предполагается, что для эффективной инцизии, ХРС должен взаимодействовать с раскрученной нитью ДНК напротив повреждения, и после загрузки TFIIH, XPD-гели-каза при продвижении в 5’—>3’ направлении немедленно наталкивается на повреждение.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >