Генетическая паспортизация биологическими чипами

В каждой клетке есть определенная группа генов, которая включена постоянно. Как же можно узнать - активен ген или пассивен? Для этого в лабораторных условиях синтезируют пробу РНК одного из генов, благо геном расшифрован полностью, и обрабатывают ею образец ткани зародыша. Если в данном образце исследуемый ген активен - в ткани присутствуют молекулы мР11К, комплиментарные пробе PI I К. В результате их взаимодействия молекула РНК пробы прочно «сплетается» с мРНК ткани - происходит гибридизация. Проба РНК помечена специальными молекулярными маркерами, которые при обработке определенными химическими агентами дают цветную реакцию, поэтому в месте экспрессии гена ткань окрашивается в синий цвет.

Эта же технология, с помощью которой происходит создание атласа экспрессии генов, использовалась как основа работы биологических чипов (далее - биочипов). Все разработки ее в России связаны с именем недавно ушедшего из жизни директора Института молекулярной биологии академика РАН А. Мирзабекова.

Биологические чипы предназначены для быстрого определения нуклеотидной последовательности ДНК в исследуемой пробе. Генетический код человека хранится в виде двойной спирали ДНК, образованной двумя полимерными цепями. Каждая из этих цепей представляет собой длинную последовательность, образованную из четырех нуклеиновых кислот: аденина, гуанина, тимина и цитозина. При этом последовательность одной цепи однозначно определяет последовательность другой, поскольку нуклеиновые кислоты, расположенные на одинаковых позициях в разных цепях, являются комплементарными. Когда две цепи объединяются в спираль, между комплементарными нуклеиновыми основаниями образуются водородные связи, которые и удерживают цепи вместе. И именно на способности комплементарных оснований образовывать химические связи основан принцип действия биологических чипов.

Технологически биочип представляет собой матрицу, состоящую из сотен и тысяч ячеек. В каждой из ячеек закреплен олигонуклеотид - последовательность из нескольких нуклеиновых кислот. Длина олигонуклеотидов во всех ячейках одинаковая, отличаются они лишь последовательностью нуклеиновых кислот. Исследуемая ДНК режется на кусочки и проходит предварительную обработку, которая заключается в том, что к каждому из кусочков прикрепляется флуоресцентная метка. Так получается набор из огромного числа маркированных олигонуклеотидов, являющихся составными частями исходной ДИК. Далее исследуемый образец наносится на все ячейки чипа, а затем, спустя некоторое время, смывается. Если в наборе имеется олигонуклеотид, комплементарный закрепленному в ячейке, между ними образуется связь, и при промывании он не будет удален, в отличие от олигонуклеотидов, которым не нашлось комплемента. После промывки чип помещается в специальный флуоресцентный микроскоп, где по световому сигналу, «метящему» ячейки с образовавшейся парой цепей, определяется состав проб: носителем этой информации оказываются интенсивность и цвет излучения. В самом деле, «светящиеся» ячейки однозначно кодируют олигонуклеотиды исходной пробы: зная олигонуклеотиды, которые были изначально помещены в данные ячейки, и учитывая однозначность образования пар, можно сделать вывод о составе фрагмента исследуемой ДНК.

Особенность российских биочипов в том, что их ячейки заполнены гелем трехмерной структуры. Такие гели удерживают большее количество пробы, нежели двумерные, и потому чувствительность отечественных биочипов выше, а следовательно, ниже требования к регистрирующей аппаратуре. Немаловажно и то, что реакции в объемном геле протекают так же, как и в жидкостях, - а значит, как и в живом организме. Это позволяет получить результат, максимально приближенный к реальности.

В России лидером в технологии создания биочипов является Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Порядок проведения анализа с использованием тест-системы «ЛК-БИОЧИП» этого института включает: получение лейкоцитов из костного мозга или крови пациента; выделение РНК из лейкоцитов; обратная транскрипция и два раунда мультиплексной полимеразной ценной реакции (ПЦР) - амплификация необходимых для анализа фрагментов кДНК, определяющих наличие транслокации, и гибридизация - взаимодействие флуоресцентномеченых продуктов ПЦР с зондами на биочипе; анализ флуоресцентного свечения ячеек биочипа при помощи прибора «Чип- детектор» и программы Image Ware.

Нанотехнология биочинов, разрабатываемых и внедряемых этим институтом, позволяет в течение нескольких часов идентифицировать, в частности, туберкулез и его лекарственно-устойчивые формы (49 мутаций). Созданы чины для анализа ВИЧ, гепатитов В и С (36 подтипов), простого герпеса, особо опасных инфекций (чума, сибирская язва, оспа), а также хромосомных нарушений при онкозаболеваниях.

Специалисты ГУ ПИИ экспериментальной медицины РАМН разрабатывают биологический микрочин для выявления на ранней стадии одного из тяжелых осложнений сахарного диабета - диабетической нефропатии. Биочин способен уловить очень маленькие концентрации альбумина в моче, которые свидетельствуют о поражении почек, и позволяет отслеживать изменение этого показателя в течение всего лечения.

В Гематологическом научном центре РАМН создают белковые биочипы на основе иммуноглобулинов, которые позволяют найти в крови возбудителей различных заболеваний, а также антитела, гормоны, цитокины и опухолевые клетки.

На Западе исследователи пошли но другому пути и разработали для создания ДНК-чипов процесс фотолитографии, аналогичный процессу производства кремниевых процессоров. Например, Affiihetrix (США) создал GeneChip-технологию, основанную на высокоплотных чипах, содержащих ДНК-последовательноети, и предназначенную для анализа генетической информации человека.

Примером другой, более простой в реализации идеи биочипов является разработка группы ученых из Калифорнийского технологического института и Института системной биологии, которая называется «Комплексный штрих-кодовый чип крови» (2008). Капельку крови подают в очень узкий канал на поверхности чипа и под небольшим давлением заставляют кровь пройти вглубь.

От главного канала отходит множество боковых, еще более тонких. Клетки крови в них не могут протиснуться, а плазма проходит свободно. Теперь она оказывается в коридоре, который внешне напоминает штрих-код: поперек этого русла лежит большое число полосок шириной 20 мкм. Каждая полоска покрыта специфическими антителами, притягивающими только один определенный белок. После того как кровь прореагировала с полосками, чип отправляют на «проявку». Тогда те полоски, что поймали белки, начинают флуоресцировать красным, причем тем интенсивнее, чем больше молекул-биомаркеров они собрали.

В пресс-релизе Калифорнийского технологического института говорится, что Хит и его коллеги построили несколько таких чипов, каждый из которых способен одновременно выполнять отдельный анализ крови для восьми пациентов, да еще и сразу по нескольким десяткам белков. А в течение 2010 г. исследователи намерены довести возможности IBBC до распознавания 100 разных белков.

Нас ждет тотальная генетическая паспортизация всего живого, мониторинг экспрессии тех или иных генов с помощью биочинов и лечение препаратами, активирующими или ингибирующими тот или иной ген.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >