Лекция 4 МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАДИАЦИОННОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА КАК ОДНА ИЗ ОСНОВ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Н.М. Борисов

Системная биология — это один из путей конверсии деятельности большого числа физиков во всем мире, которым перестало хватать работы в связи с уменьшением спроса на собственно физические, главным образом оружейные, исследования и разработки. Если специалисты с физическим образованием знают основы биологии, они могут разобраться в современных биологических проблемах, а так как у них хорошая подготовка по специальностям прикладная математика и физика, то они могут обеспечить внедрение нового подхода в решении биологических проблем.

Ознакомимся с тем, как смотрят физики па клеточно-молекулярную радиобиологию. Начнем с физической подоплеки явления: ионизирующие частицы как заряженные (электроны, протоны, адроны, мезоны), так и незаряженные (фотоны, нейтроны), теряют энергию при прохождении через вещество. Тот запас свободной энергии, которая существует в мире, в конечном итоге превращается в тепловое движение, в энтропию, через цепочку превращений. Применительно к процессу поглощения энергии ионизирующего излучения это означает, что процессы ядерного, а также электромагнитного взаимодействия, сменяются процессами химического взаимодействия (разрушения или изменения межатомных связей в сложных биомолекулах), а неизрасходованная па разрушение химических связей энергия переходит в энергию теплового движения. Соответственно каждый из этих процессов описывается конверсионным (кинетическим) показателем (линейным коэффициентом потерь энергии, линейной плотностью энергии, относительной биологической эффективностью, и, наконец, риском возникновения каких-либо нежелательных биологических последствий), а также характеристиками поля излучения.

Отвлекаясь от взаимодействия излучения с веществом, поле излучения можно характеризовать с помощью таких величин, как флюенс (число частиц, приходящееся на единицу площади поверхности), плотность потока (флюенс в единицу времени), а также плотность потока энергии (плотность потока частиц, умноженная на энергию частиц для моноэнергетического излучения; при немоноэнергетиче- ском излучении эта величина определяется интегрированием по энергии. Напротив, дозовые величины призваны количественно описать процесс взаимодействия излучения с веществом. Самой простой из них является поглощенная доза D, т.е. энергия излучения, которая по завершении облучения остается в объеме облучаемого вещества, отнесенная к массе данного вещества.

Величина, называемая «керма» (К, kinetic energy released in wr/tter), равная кинетической энергии заряженных частиц, которые выделяются при первичном взаимодействии ионизирующего излучения с веществом, в единице массы вещества. Воздушной керме пропорциональна экспозиционная доза X, равная отношению суммарного заряда вторичных заряженных частиц при прохождении ионизирующих фотонов (рентгеновских, гамма-фотонов) через воздух, к массе этого воздуха. Хотя теоретически керма больше поглощенной дозы за счет части энергии заряженных частиц, уносимых из облучаемой области с тормозным излучением, в большей части практических случаев контакта живых организмов с ионизирующим излучением этим различием можно пренебречь. Важным исключением из этого правила является лучевая терапия на высокоэнергетических ускорителях, при которой электронное равновесие часто не достигается из-за большой длины пробега вторичных электронов. В таком случае важно понимать, что газоионизационные дозиметрические приборы, применяемые в лучевой терапии, измеряют, как правило, керму, а не поглощенную дозу [1], и для ее перевода в поглощенную дозу, которую «отпускают» пациентам по предписанию врачей, применяют поправочные коэффициенты.

Как вам рассказывали биологи, наиболее опасным эффектом повреждения биологических молекул при облучении являются двунитевые разрывы ДНК. Существуют, конечно, и однонитевые разрывы, их больше, чем двунитевых, но, тем не менее, они восстанавливаются практически всегда. Что касается двунитевых, то хотя большая часть их восстанавливается, вероятностью их неправильного восстановления нельзя пренебрегать.

Существует два механизма разрывов ДНК — непосредственный от первичных или вторичных заряженных частиц, треки которых проходят через ядро сквозь молекулы ДНК, и косвенный — от химических радикалов. В зависимости от типа первичного излучения относительная роль механизма, вызывающего разрывы ДНК, может быть разной. При редко ионизирующем излучении (фотоны, электроны) вторичные частицы вызывают 60 % разрывов, химические радикалы — 40 % разрывов, а при плотноионизирующем (протоны, нейтроны, альфа-частицы, тяжелые ионы) соотношение разрывов ДНК, вызываемых заряженными частицами и химическими радикалами, составляет 80 и 20 % соответственно [2]. При рассмотрении процессов превращения энергии в объемах, сопоставимых с объемом ядра клетки, следует помнить, что при достаточно малых дозах, сравнимых с фоновыми, акт поражения геномного аппарата клетки становится стохастическим, и большая часть ядер клеток может и не испытать двунитевого разрыва цепочки ДНК. Исторически такой микродозиметрический подход послужил основой для определения А.М. Келлерером [3] малой дозы как дозы, при которой долей ядер, через которые проходят два трека (или более) заряженных частиц, можно пренебречь. Тем не менее, так определенная малая доза

составляет всего для гамма-излучения ⁶⁰Со 0,2 мГр [4, 5] для фотонного излучения. При такой дозе (по крайней мере, если отвлечься от вредных последствий на плод) никто не наблюдал достоверно вредные последствия — как детерминированные, так и стохастические (в самом деле, эта доза меньше годового среднего фонового уровня доз) [6].

Как же можно количественно выразить меру воздействия ионизирующего излучения на живой организм? Концепция эквивалентной дозы Н призвана учесть тот факт, что различные частицы имеют разную линейную передачу энергии (ЛПЭ). Соответственно для редко- и плотноионизирующего изучения плотность потока энергии вторичных заряженных частиц является существенно разной, разной будет и концентрация химических третичных агентов, и количество двуните- вых разрывов. Учитывают такие различия с помощью взвешивающего коэффициента излучения ч’_к, равного отношению доз, вызывающих одинаковые биологические эффекты, от эталонного (фотонного) О_х и от исследуемого излучения О_к зг_л = й_хЮ_к. Значение коэффициента и’_л зависит (разброс может быть трехкратным и более [7]) от множества факторов, кроме типа излучения: это и вид живого организма (для бактерий — свой, для дрожжей — свой, для высших эукариот — свой), и тип биологического эффекта (клеточная гибель, острые лучевые поражения или риск проявления отдаленных последствий излучения), и диапазон доз, а также мощностей дозы [6]. Определение коэффициента >_к является нетривиальной задачей, решение которой достигается путем нелегкого консенсуса в экспертном сообществе. При табулировании такого коэффициента для разных типов излучения Международная комиссия по радиационной защите (МКРЗ) исходит из консервативного принципа «лучше перебдеть, чем недобдеть» и принимает в качестве х’_к такое значение, которое является оценкой сверху для большинства значений и’_й, полученных для разных биологических эффектов [7].

Величина, называемая эффективной дозой Е, была введена для учета влияния разной органотканевой радиочувствительности по канцерогенному эффекту и может быть использована для приведения неравномерного облучения к имеющему такую же опасность условно-равномерному с помощью взвешивающих коэффициентов и’у органов и тканей: Е = ?н’_ТН_Т. При определении взвешивающих коэффициентов органов и тканей ’_т используют результаты наблюдений за когортами облученных лиц (в Хиросиме/Нагасаки, на ПО «Маяк», в Чернобыле и др.): взвешивающие коэффициенты органов и тканей делают пропорциональными относительному выходу онкологических заболеваний тех или иных органов у облученных лиц [8].

Известно, что существует два разных класса радиобиологических эффектов: детерминированные и стохастические. К детерминированным относятся клеточная гибель, также их следствия — острая лучевая болезнь, местные лучевые поражения, лучевые катаракты и др. Та же острая лучевая болезнь, например, имеет в зависимости от дозо- вого диапазона три основных синдрома, которые приводят к гибели человека. В диапазоне от 1 до 10 Гр при общем облучении всего тела — это гематологический или костномозговой синдром, при котором летальный исход, если он наступает, то происходит от лейкопении. В диапазоне от 10 до 50 Гр наблюдается кишечный синдром с геморрагической диареей и обезвоживанием [9]. Наконец, при чрезвычайно высоких дозах (выше 50 Гр острого равномерного облучения; этот случай изучен на животных) — от синдрома поражения центральной нервной системы (ЦНС) (массовая гибель клеток головного мозга) [9]. У местных лучевых поражений степень тяжести тоже сильно зависит от дозы и объема пораженной ткани/органа. У всех этих эффектов одна общая характеристика — кривая зависимости «доза — эффект» имеет логистический, сигмоидальный вид с ярко выраженным порогом проявления эффекта. Ниже этого порога наблюдается строгое отсутствие клинического эффекта, значительно выше его — 100 %-ная вероятность развития.

Второй же класс биологических эффектов — стохастические (такие, как рак или мутагенез) — проявляются совершенно иным образом. Для них существует ненулевая вероятность возникновения эффекта при дозе, равной естественному фону. С ростом дозы вероятность манифестации эффекта увеличивается, но характер зависимости вероятности проявления эффекта определить сложно из-за большой статистической погрешности. Так какую зависимость кривой «доза — эффект» — пороговую или беспороговую — следует предпочесть?

Может быть, ответ на этот вопрос следует искать в области медицинской статистики и эпидемиологии? Однако при исследовании радиационно-зависимых наследственных мутаций, передаваемых из поколения в поколение у человека, наблюдать достоверную картину увеличения их частоты с ростом дозы так и не удалось за сто лет существования радиобиологии. По ракам и лейкозам информации больше. Чтобы уменьшить статистическую погрешность, нужны выборки многомиллионной мощности. Число же жертв бомбардировки Хиросимы и Нагасаки было меньше миллиона, и в атомной промышленности пока не работают миллионы людей. Некоторые ранние прогнозы избыточной заболеваемости раками среди ликвидаторов последствий аварии па Чернобыльской АЭС и жителей загрязненных в результате этой техногенной катастрофы территорий предрекали большое (в несколько раз) увеличение онкологической заболеваемости у этих категорий лиц. Тем пе менее, в чернобыльских когортах достоверного увеличения частоты злокачественных заболеваний выше фонового уровня не было обнаружено, за исключением уровня лейкозов (кроме хронического лимфолейкоза) у ликвидаторов, а также рака щитовидной железы (главным образом у детей, потреблявших молоко от коров, находящихся в частных хозяйствах, что было обусловлено большой дозовой нагрузкой для детей [10]), и различных видов солидных раков у тех ликвидаторов, которые получили дозы выше 150 мГр [11].

При проведении статистико-эпидемиологических исследований чрезвычайно существен адекватный выбор контрольной группы. К сожалению, в России учет онкологической заболеваемости среди значительного числа людей, не имеющих отношения к профессиональным вредностям, до сих пор зачастую ведется неудовлетворительно. Если умирает человек в возрасте, патологоанатом может и не искать причину смерти, даже если это на самом деле был нераспознанный рак. Тем не менее, даже с учетом такой «недодиагностики» рака у населения формальное применение данных статически о не работающем на вредных производствах населении приводит к парадоксальному выводу: уровень заболеваемости раками у населения оказывается выше, чем у работающих в атомной промышленности (особенно ярко этот эффект прослеживается в богатых странах, где «недодиагиостики» раков у населения меньше [12]). Этот феномен получил название «эффект здорового работника»: сам факт профессионального отбора на вредные производства означает изначально лучшее состояние здоровья работников, что выражается в меньшем уровне раковых заболеваний [13].

Даже в богатых странах выбор контрольной группы может быть неадекватным, как показывает опыт современного исследования, проводимого в Австралии. Дело в том, что в экономически развитых странах наибольший вклад в дозу как среди непрофессионалов, так и среди персонала радиационно-опасных производств стали составлять медицинские процедуры; наиболее существенна тут компьютерная томография (КТ). По этому поводу в Австралии сейчас идет набор статистики по дозам от КТ, при этом большие дозы от КТ коррелируют с большей вероятностью развития рака. Однако не путаем ли при этом мы причину со следствием, не делают ли чаще КТ людям, у которых (хотя бы в силу неблагополучного родственного анамнеза) чаще подозревают рак?

Если эпидемиологический подход сопряжен с такими методическими трудностями, то, может быть, поможет экспериментальный? К сожалению, нет такого вида животного, на котором можно было бы проверить наличие или отсутствие дозового порога повышенного образования рака у человека. Мелкие животные (мыши, крысы) не могут служить полностью адекватной моделью в радиобиологии человека, потому что они живут недолго, и у них совсем другой даже в отсутствие всех дозовых нагрузок временной график выхода рака: у человека такого не бывает, что начиная с какого-то возраста вся популяция непременно начинает заболевать раком (а у мышей это обычное явление). Эксперименты на крупных животных дороги и поэтому тоже не могут обеспечить нужной мощности статистической выборки.

Если экспериментальный подход, как и эпидемиологический, является не всесильным, может быть, перспективы есть у системнобиологического подхода, в котором используются математические вычисления, расчет и анализ? Прежде всего скажем, что системная биология — это достаточно тавтологичный термин, как масло масляное, потому что система — это нечто целое, состоящее из составных частей таких, что поведение этого целого определяется не столько поведением отдельных частей, сколько взаимодействием между частями. Таким образом, любой биологический объект есть система, а любая биология есть исследование систем. Однако термин «системная биология» традиционно употребляется при математическом моделировании и анализе сложных биологических процессов на разном уровне: от молекулярно-клеточного до органного и организмен- иого (органно-организмениого) и популяционно-биосферного.

Посмотрим теперь глазами системного биолога (т.е. с точки зрения математических расчетов) на проблему порога стохастических (главным образом онкологических) эффектов облучения. Клеточная пролиферация подготавливается большим количеством взаимодействий белков и генов. Временная зависимость активации ключевых белков-эффекторов (их известны десятки, если не сотни) может быть критичной для митогенетической судьбы клетки (рис. 1) [14].

Изучены уже сотни митогенетических сигнальных путей, каждый из них характеризуется взаимодействием, как правило, сотен соответствующих белков и генов. Основные про- и антимитотические сигнальные пути были экспериментально определены уже где-то на рубеже веков. Тем не менее, тогда это была только качественная, а не количественная картина. Количественная картина была получена уже в XXI в. математическими методами. Эти методы были заимствованы из ферментативной кинетики; согласно этим методам описание белок-белкового взаимодействия проводится в «элементарном», «низкоуровневом» приближении с помощью закона действующих масс. Строение большинства белковых молекул — переносчиков митогенетического сигнала — исследовано, главным образом, с помощью рентгеноструктурного анализа; изучены также основные способы связывания молекул с молекулами. Как следствие, комбинаторная сложность возникающих при этом графов сигнальных путей является просто невообразимой (очень малый фрагмент сигнального пути, описывающий взаимодействие лишь начальных молекул-пере- посчиков сигнала, изображен на рис. 2 [15]).

При моделировании активации сигнальных каскадов можно предложить анализ двух предельных случаев. Прежде всего, это абсолютно конкурентное связывание партнеров на многоцентровых белках. Это удобнее для моделирования: не бывает комбинаторной сложности. Противоположным вариантом является абсолютно независимое связывание партнеров на многоцентровых белках; при этом необходимы количественные методы редукции моделей. Но реально между этими двумя крайностями всегда имеется промежуточный случай — наличие аллостерических взаимодействий между партнерами. По отношению к моделированию это очень неудобно. Основной метод в этом случае — ограничение числа молекул в комплексе

Рис. 1. Временная зависимость активации межклеточной регуляторной киназы (ERK) определяет судьбу клетки.

Быстро убывающая активация (а, кривая 1) после стимуляции пейробластов эпидермальным ростовым фактором (EGF) приводит к пролиферации с риском злокачественных трансформаций (б), а продолжительный сигнал (а, кривая 2) может инициировать экспрессию генов, отвечающих за дифференцировку клеток («)

при рассмотрении: больше пяти-шести молекул в белковом комплексе с физической точки зрения не бывает.

Математики предложили несколько программных пакетов, которые позволяют моделировать агрегацию комплексов сколь угодно большой сложности. К наиболее универсальным и быстродействующим компьютерным программам для расчетов активации сигнальных путей относится программа Вю№10еп 2.

Метод уменьшения числа переменных, реализованный нами для программы ВюЫе10еп 2, основан на анализе отношений зависимости

Рис. 2. К описанию состоянии многосайтового белка .V. Связывание с мембранным рецептором /? происходит через домен/саит А. Для не связанных с рецептором форм А = 0, для связанных А = 1. Кроме того, .V имеет два тирозиновых остатка, состояния которых означают следующее:

О — свободный нефосфорилированный (У); I — свободный фосфорилированный (рУ); 2 — занятый партнером (рУ-А); 3 — занятый фосфорилированным партнером (рУ-рА)

между сайтами молекул-переносчиков сигнала. Рассмотрим систему, включающую в себя один многосайтовый цитоплазматический белок 5, который связывается с рецепторной тирозин-кииазой Я через специфический домен И. После этого белок 5 может фосфорилироваться рецептором по нескольким тирозиновым остаткам /'(/'= 1, ..., п), расположенным вне домена И. Разделение переменных, описывающих разные зависимые (от управляющего сайта И) сайты / (/' = 1, ..., п), значительным образом уменьшает число переменных в системах обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ). Модуль уменьшения числа переменных для программы ВюЫшСеп 2 осуществляет следующие операции:

построение системы виртуальных белков на основе анализа отношений контроля/зависимости между сайтами;

обеспечение закона сохранения масс в моделях с использованием виртуальных белков.

В табл. 1 показано, насколько наш модуль [16] сокращает число переменных в системах ОДУ, а также время расчетов по программе Вю№10еп 2. Хотя эти две тестовые задачи имеют малое число типов

Таблица I. Сокращение числа переменных в системах ОДУ, созданных с помощью программы ВюМеЮеп 2. Структура и взаимодействие молекул представлены на рис. 2

* На персональном компьютере с процессором с тактовой частотой 2,80 ГГц и объемом оперативной памяти 1 Гб.

белков (всего четыре), а также правил реакций, сокращение числа переменных и времени расчета достигает десятков и сотен раз. В то же время даже сокращенные с помощью нашего алгоритма системы ОДУ включают десятки, если не сотни комплексов и сотни реакций; подготовка таких моделей «вручную» выглядит проблематичной. Относительная разница между результатами активации сигнальных каскадов, рассчитанными с помощью полных и сокращенных моделей, не превышает 10 ⁶ (что соответствует пределу толерантности реализованных в ВюИ^Сеп 2 алгоритмов Рунге—Кутты для интегрирования ОДУ).

Не меньшую трудность при моделировании активации сигнальных каскадов представляют неизвестные кинетические параметры. Надо отметить, что использование методов вычислительной математики в задачах классической физики/химии и современной биологии различно. Вычислительная математика была развита, прежде всего.

для решения прямых задач таких, как, например, задача Коши, т.е. для решения которых количественные законы были известны и относительно просты: в физике это законы Ньютона, в химии — закон действующих масс и т.д. В биологии количественные законы гораздо сложнее и не всегда известны, поэтому для их исследования практически всегда приходится решать обратные задачи вычислительной математики. Сущность этих обратных задач — это оценка большого количества свободных параметров, которые не всегда можно измерить в эксперименте непосредственным образом. Проблема свободных параметров не нова в вычислительной математике. Здесь можно сказать, что наличие у гипотезы математической модели не должно зачаровывать естествоиспытателя.

Самой простой исторической аналогией может служить астрономия. Началась она с неверной гипотезы — с геоцентризма, постулировавшего недвижимость Земли. Многие столетия геоцентрическая система укладывалась в данные наблюдений. Однако к началу эпохи Возрождения возникла проблема несоответствия наблюдаемых данных и классического птолемеева геоцентризма. В эпоху Возрождения было предложено два подхода к астрономии. Коперник, а за ним Кеплер и Ньютон, предложили смену парадигмы в астрономии, переход от геоцентризма к гелиоцентризму. Но можно было действовать и по-другому. Был астроном Тихо Браге, который хотел сохранить геоцентризм, привычный тем, что мы видим, что Земля покоится, а все небесные явления объяснить подгоном свободных параметров. В рамках системы Тихо Браге имелись дифференты, по которым вращались центры эпициклов, а сами планеты вращались по эпициклам (рис. 3).

Подгонкой свободных параметров (таких, как радиусы эпициклов и число эпициклов высшего порядка) можно было объяснить любые наблюдаемые астрономические данные. Мы живем в космическую эру, когда система Тихо Браге опровергнута экспериментально, в ходе запусков аппаратов к различным планетам. Тем не менее, космическая эра насчитывает менее 60 лет. Отказ же от геоцентризма произошел еще в эпоху раннего модерна. Произошло это потому, что со времен Ньютона люди получили возможность предсказывать поведение небесных светил. В соответствии с геоцентризмом, как предлагал Браге, можно накладывать эпициклы один на другой до бесконечности, но это будет апостериорная подгонка параметров. Никакого нового знания, никаких новых предсказаний мы таким способом получить не сможем.

Рис. 3. Геоцентрическая система Тихо Браге (а) и гелиоцентрическая система Коперника (б)

Теория всемирного тяготения Ньютона, которая основывалась па гелиоцентризме, могла предсказывать поведение новых объектов. Были найдены Уран, Нептун, затем Плутон и другие объекты в Солнечной системе, которые по результатам возмущения движения уже известных планет можно было искать и находить. И только эта предсказательная способность гелиоцентризма и предсказательная бесплодность геоцентризма привели к тому, что пи один астроном уже в XVIII в. в геоцентризм не верил. Значит, если мы занимаемся математическим моделированием и оценкой каких-то свободных параметров, то мы не должны впадать в ошибку, в которую впал Тихо Браге. Свободные параметры можно «модифицировать», но этого нельзя делать до бесконечности. На каком-то этапе оптимизацию параметров надо будет прекратить и посмотреть, какую предсказательную силу будет иметь модель.

Чтобы добиться экспериментальной верифицируемости таких моделей, используют следующий метод [17]. Сначала массив неизвестных кинетических параметров оптимизируют так, чтобы он наилучшим образом описывал совокупность экспериментальных данных по временной зависимости активации основных эффекторов для разных концентраций инициирующих лигандов. Во время процесса оптимизации (подгонки параметров) нужно быть осторожным, чтобы не выйти за пределы значений кинетических параметров, которые известны из экспериментальных данных. Кроме того, скорость реакции не должна превышать диффузионного предела. Затем, чтобы сделать модель надежной, после завершения оптимизации значений параметров формулируют предсказания, поддающиеся экспериментальной проверке. Такие предсказания могут касаться, например, ингибирования определенных ферментов или увеличения/ снижения полной концентрации определенных белков (в результате повышенной экспрессии белка или, напротив, временного прекращения синтеза белка в результате воздействия короткой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК)). Примером может служить наша разработка в программной среде BioNetGen 2. Структурно-функциональная схема сигнального пути представлена на рис. 4.

Распространение сигнала начинается с активации рецептора на клеточной мембране. После связывания с лигандом (EGF) рецептор димеризуется и подвергается трансфосфорилированию в тирозипо- вых аминокислотных остатках (pY) (см. рис. 2). Эти остатки могут связать адаптерные белки She и/или Grb2 (которые, в свою очередь, связываются с фактором обмена гуанина SOS), р85-субъединицу фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), фосфолипазу С, (PLC_Y)

Рис. 4. Структурно-функциональная схема модели активации межклеточной регуляторной киназы (ERK) в ответ на симуляцию клетки эпидермальным ростовым фактором (EGF). Сплошные линии со стрелками показывают активацию или фосфорилирование тирозином белков и липидов. Пунктирные линии отражают направления белок-белок и белок-лнпидных взаимодействий. Красные линии без стрелок соответствуют процессу ингибирования

и ГТФазу RasGAP. Все соединения, которые содержат фосфорилиро- ванный EGFR, могут быть подвергнуты эндоцитозу и деградации с освобождением обязательных партнеров EGFR. Активация тирозин-киназы Src также обусловлена, главным образом, воздействием EGFR.

Важную роль в усилении возбуждения эффекторного каскада Ras/ MEK/ERK играет адаптерный белок GABI (см. рис. 5, левая колонка. Он захватывается клеточной мембраной с помощью фосфатидилино- зитол-(3,4,5)-трифосфата (Р1Р₃) через домен, гомологичный плекст- рину (PFl-домен). Связанный с мембраной либо через Р1Р₃, либо через Grb2-(SFIC)-EGFR, GABI может быть фосфорилирован киназой EGFR или Src, за этим следует связывание с Grb2, PI3K, RasGAP (для простоты мы полагаем конкурентное связывание этих партнеров с GABI ) или с фосфатазой SHP2. Связанная с GABI фосфатаза SHP2 дефосфорилирует тирозиновые остатки на GABI, а также на EGFR.

Кроме того, Grb2 (рис. 5, правая колонка) также является многосайтовым белком. Он имеет два SFB-домена (N-терминальный домен специфически связывает SOS, а С-терминальный связывает GABI). Кроме того, SFB-домен белка Grb2 связывает фосфотирозиновые остатки как на EGFR, так и на GABI.

Чтобы определить различие между двумя способами связывания GAB 1 с Grb2, мы создали два варианта сигнальной модели, которые условно назвали А и Б (рис. 5, верхний и нижний ряды соответственно). Единственное различие между белок-белковыми взаимодействиями в модели А и Б заключается в способе связывания Grb2 с GABI. В то же время в модели А мы предполагаем, что эти белки связываются один с другим через домен, обогащенный пролином (prd), белка GABI и С-терминальный SFB-домен Grb2, в модели Б эти белки связываются с помощью одного из многочисленных тиро- зиновых остатков GABI и SFB-домен Grb2.

Примембранная PI3K вызывает переход входящего в состав мембраны фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфата (PIP2) в фосфатидилино-

Рис. 5. Структу ра домеиов/сайтов и связи между партнерами для двух адаптерных белков САВ1 и СгЬ2 в соответствии с вариантами А (верхний ряд) и Б (нижний ряд) модели сигнальных путей. Прямоугольники представляют собой белки, голубые овалы — домены белков, оранжевые овалы — тирозиновые остатки

зитол-(3,4,5)-трифосфат (PIP3), PI33 связывается с адаптерным белком GABI и серин/треонин-кииазой PDK1. Примембранная PDK1 вызывает фосфорилирование серин/треопин-киназы АКТ на остатке Thr308.

Фактор гуанинового обмена SOS, находясь вблизи клеточной мембраны, преобразует гуаниидифосфат (GDP), находящийся в комплексе с Ras, в гуанинтрифосфат (GTP); обратный процесс катализируется примембранным RasGAP. Комплекс Ras-GTP вызывает первичную активацию Raf, однако для полной активации Raf необходим активный Sic. Активный Raf вызывает активацию (двойное фосфорилирование) МЕК. Активный МЕК вызывает последовательное фосфорилирование ERK.

Будучи серин/треонии-киназой активный ERK осуществляет отрицательную обратную связь в процессе распространения сигнала, фосфорилируя серин/треониновые ингибирующие сайты па молекулах SOS и GABI.

Чтобы сделать модель надежной, после завершения установки параметров нужно формулировать предсказания, поддающиеся экспериментальной проверке. Такие предсказания могут касаться, например, ингибирования определенных ферментов или увеличения/ снижения полной концентрации определенных белков (в результате повышенной экспрессии белка или, напротив, временного прекращения синтеза белка в результате воздействия короткой интерферирующей РНК).

На рис. 6 представлены результаты оптимизации нашей модели па примере кривых активации ERK и АКТ. Модели А (верхний ряд) и Б (средний ряд) были оптимизированы для трех значений начальной концентрации свободного EGF (20 нМ/л, 1 нМ/л и 0,1 нМ/л), а также для случаев добавления вортманнина (WT), ингибитора PI3K в соответствии с экспериментальными данными (вестерн-блот- тинг на клетках линии НЕК293; нижний ряд рисунков). Хотя формы кривых активации для моделей А и Б не всегда строго одинаковы, невозможно было с определенностью сказать, какая из моделей лучше описывает экспериментальные данные. Такой же вывод может быть сделан для кривых активации GABI, Ras и МЕК.

Ранее нами была показана решающая роль GABI как усилителя митогенетических сигналов при стимуляции EGF [18, 19]. Когда GABI накапливается на мембране через PIP3, он может связать Р13К, которая в свою очередь производит больше PIP3, увеличивая таким образом концентрацию примембраиного GABI и завершая петлю положительной обратной связи. Эффекты нарушения цикла обратной

Рис. 6. Результаты подгонки свободных параметров модели к описанию экспериментальных данных по активации ERK (левая колонка рисунков) и АКТ (правая колонка):

верхний ряд — вариант модели А; средний ряд — вариант модели Б; нижний ряд — экспериментальные данные, полученные методом вестерн-блоттинга на клетках линии НЕК293

связи при снижении полной концентрации GABI в клетке, которые мы предсказали с помощью вычислений в наших более ранних работах, были экспериментально проверены методом короткой интерферирующей РНК.

Расчеты (рис. 7) показывают, что только модель Б (рис. 7, б) могла воспроизвести экспериментально проверенные прогнозы о влиянии

Рис. 7. Результаты предсказания модели о последствиях снижения полной концентрации GABI в клетке (с помощью короткой интерферирующей РНК) для активации ERK в ответ на стимуляцию клеток линии НЕК293 эпидермальным ростовым фактором в дозе 0,1 н.М/л:

а — модель Л; б — модель Б. Синяя линия — нормальное содержание GABI в клетке. Линии другого цвета отражают пониженное содержание GABI в клетке; « — результаты измерения методом вестерн-блоттинга снижения полной концентрации GABI на активацию ERK при стимуляции EGF. Наоборот, модель А (рис. 7, а) не предсказывает снижения активации ERK даже при полном удалении GABI из клетки. Этот необычный эффект обусловлен специфичным «секвестрирова- пием» белка Grb2 с помощью белка GABI в модели А. Если большой GAB 1-содержащий комплекс связывается с Grb2-EGFR- или Grb2- SHC-EGFR-комплексом через С-термииальиый БНЗ-домен Grb2, то в результате число молекул в образовавшемся комплексе может превышать предельно допустимое (при построении модели мы предполагали, что комплекс не может содержать более пяти молекул), таким образом запрещая присоединение SOS к Grb2 через его N-термииаль- ный БНЗ-домен. Однако в модели Б GABI и EGFR не могут связываться с Grb2 одновременно (рис. 7, в), так что GABI не может «секвестрировать» примембранный (через EGFR) Grb2 из пула комплексов, которые могут прикреплять SOS к мембране.

Следует отметить, что опытным путем решить вопрос о степени адекватности сценариев А или Б было бы очень трудно. Прямые измерения могут быть сделаны с помощью тройного иммуноблот- тинга (обнаружения некоторых фосфотирозиновых остатков в копре- ципитате Grb2 в преципитате GABI), который имеет очень низкую эффективность регистрации и, следовательно, большие относительные ошибки. Эксперименты с мутантными белками (например, замена GABI тирозинового остатка, который связывает БШ-домен Grb2, фенилалаииновым остатком) неизбежно вовлекают в эксперимент животных (например, мышей), что в свою очередь может ввести дополнительную неопределенность в связи с различием в геноме и про- теоме между человеком и мышыо.

А на какие еще вопросы системная биология сигнальных путей может дать ответ сейчас? Что касается вопроса о существовании порога стохастических эффектов облучения, то на него отвечать даже методами системной биологии пока преждевременно, потому что до сих пор неизвестны детали реакции сигнальной системы клетки (и соответственно прогрессии клеточного цикла) на те или иные ее радиационные повреждения на микродозиметрическом уровне. Но чем же может помочь системная биология клинике? Некоторые пути уже есть. В частности, в XXI в. в медикаментозной терапии рака распространилось два новых класса препаратов, называемых таргетными (целевыми, мишенными): это мабы (моноклональные антитела — белки, которые связываются с активными онкогенами и ингибируют их) и нибы (низкомолекулярные ингибиторы киназ). Казалось бы, это очень важные, очень нужные и очень хорошие препараты, которые не имеют побочных эффектов в виде плохого самочувствия или алопеции — т.е. всего, что создает тягостный имидж ракового больного и чего больные боятся. И значит, таргетные препараты должны бы воздействовать только на патологически пролиферирующие, т.е. на раковые клетки, и не должны воздействовать па нормально пролиферирующие клетки, например па клетки эпителия, которые должны нормально делиться и расти.

Тем не менее и мабы, и нибы очень часто оказываются клинически неэффективными, несмотря на то что их назначают по результатам иммуногистохимических исследований, в ходе которых определяют уровень экспрессии тех или иных онкогенов — мишеней таргетных препаратов, активность которых ингибируют мабы и нибы. Тем не менее эффективность этих препаратов даже при назначении по показаниям оказывается очень низка [20].

Для успешного применения мабов и пибов необходим учет сложной совокупности сигнальных путей в применении к конкретному случаю рака. Такой учет осуществляет система ОпсоБтбег, разработанная нами для консультирования врачей-онкологов, проводящих лечение больных со злокачественными опухолями [21]. Данная компьютерная система представляет собой базу знаний для поддержки принятия решений о назначении таргетных противоопухолевых препаратов — моноклональных антител (мабов), ингибиторов киназ (нибов), а также некоторых гормонов и стимуляторов, конкретному онкологическому больному. Исходными данными, которыми оперирует база знаний ОпсоБтбег, являются:

результаты анализа уровня экспрессии многих тысяч онкогенов и онкосупрессоров в злокачественных и нормальных клетках для конкретного пациента, полученные, например, с помощью микрочи- пового исследования матричной РНК клеток биоптата опухоли, а также в здоровых тканях, окружающих опухоль;

данные о механизмах действия, показаниях, противопоказаниях, а также стоимости таргетных противоопухолевых препаратов как предоставляемые производителями препаратов, так и находящиеся па специальных серверах публичных баз данных (БД) по лекарственным препаратам, таким как БД Эп^Вапк, которая создана при Университете Альберты (Канада);

данные о белках, генах, входящих в состав сигнальных каскадов, способствующих или препятствующих митогеиезу. Среди большого количества БД открытого доступа по про- и антимитотическим сигнальным путям наиболее полна БД компании (Да?еп.

Результатом работы системы является оценка степени патологических изменений в про- и антимитотических сигнальных путях, а также способности таргетных противоопухолевых препаратов компенсировать эти изменения, что может быть использовано для прогноза клинической эффективности препаратов для конкретных онкологических и гематологических больных. В основе базы знаний системы OncoFinder находится БД таргетных противоопухолевых препаратов, а также про- и антимитотических сигнальных путей, которая содержит информацию о взаимодействующих белках и соответствующих им генах.

При расчете количественных показателей патологических изменений в про- и антимитотических сигнальных путях у конкретных онкологических больных, а также при оценке возможности противоопухолевых препаратов компенсировать эти изменения, система OncoFinder использует следующие допущения. Во-первых, граф белок-белкового взаимодействия в каждом сигнальном пути полагают в виде двух параллельных цепочек событий: одна приводит к активации, а другая — к ингибированию сигнального пути. Во-вторых, уровень экспрессии каждого белка-переносчика сигнала в пути в состоянии покоя полагают много меньшим, чем в состоянии активации (т.е. в состоянии покоя имеет место глубоко ненасыщенное состояние каждого белка-переносчика сигнала).

Таким образом, в системе OncoFinder белки-переносчики сигнала в каждом сигнальном пути рассматриваются как имеющие потенциально равные возможности вызывать активацию/ингибирование путей. В рамках таких предположений па основе закона действующих масс может быть предложена следующая оценка патологических изменений в сигнальном пути (signal outcome — 50):

В данной формуле умножение проводится по всем находящимся в пути генам-активаторам и ингибиторам сигнала [AGEL? (activator gene expression level) и [RGEL]? (repressor gene expression level), т.е. уровням экспрессии гена-активатора № i и № j соответственно.

Проведем логарифмирование для перехода от мультипликативной величины к аддитивной относительной митогенетической значимости каскада (pathway mitogenic strength), служащей для оценки степени патологических изменений в сигнальном пути:

Здесь CNR_n {cancer(case)-to-normal ratio) есть отношение уровней экспрессии гена, кодирующего белок п, у конкретного больного к норме (среднему значению у контрольной группы). Дискретная величина BTIF (beyond tolerance interval flag) вычисляется как

Дискретная величина ARR_lip {activator/repressor role) определяется следующим образом и помещается в базу данных митогенетических путей:

Дискретная величина AMCF_p (activation-to-mitosis conversion factor)

С помощью программного комплекса OncoFinder для восьми онко- и гематологических нозологических форм был проведен сравнительный анализ различий в патологических изменениях в 80 про- и антимитотических сигнальных путях. Информация об уровне экспрессии генов у больных с различной локализацией злокачественных опухолей была взята нами с портала Gene Expression Omnibus (GEO) [22]. Доля (в процентах) сигнальных путей, для которых различие между средними значениями PMS патологических изменений в уровнях экспрессии генов-переносчиков сигнала превышает сумму стандартных отклонений для этой пары сигнальных путей, показана в табл. 2 и 3. В частности, для опухолей головы и шеи в отличие от других онкологических заболеваний специфическими путями маркерами оказываются сигнальные каскады АКТ, cAMP, Chemokine, CREB, ERK, Glucocorticoid receptor, IL-6, ILK, Integrin signaling, IP3, JNK, МАРК, p38, PAK, PPAR, STAT3, активация которых повышена по сравнению с другими типами рака, а также ингибирующий клеточную пролиферацию путь Mitochondrial apoptosis, активация котоТаблица2. Доля, %, сигнальных путей, для которых различие между средними логарифмическими значениями патологических изменений PMS в уровнях экспрессии генов-переносчиков сигнала превышает сумму стандартных отклонений

для этой пары сигнальных путей

Табл и ца 3. Доля, %, сигнальных путей, для которых различие Л между средними логарифмическими значениями патологических изменений PMS в уровнях экспрессии генов-переносчиков сигнала превышает сумму ст стандартных отклонений для данной нозологический формы и для суммы всех других нозологических форм

рога понижена по сравнению с другими онкологическими нозологическими формами.

При расчетах значения PMS в программе OncoFinder принята одинаковой важность всех генов для активации митогенетических путей, что в большинстве практических случаев не вполне соответствует действительности. Мы провели стохастическую проверку данной гипотезы для больного с глиобластомой [23] следующим образом. В расчетах значения PMS встречается суммирование по генам логарифмов , где ELC_n — уровень экспрессии гена

п у конкретного ракового больного, а ELN_n — средний уровень экспрессии того же гена в норме у той же популяции. Во время этой проверки мы случайным образом возмущали (проведя 100 независимых испытаний) относительную важность каждого гена для каждого из сигнального пути с помощью логнормально распределенных весовых факторов w_lv которые вычисляли как , где — нормально распределенные случайные числа с математическим ожиданием М = 0 и стандартным отклонением а = 0,5. Результаты такого стохастического теста показаны на рис. 8. Видно, что даже значительное возмущение весовых коэффициентов значимости генов для сигнальных путей не в состоянии замаскировать пропорциональность среднего значения возмущенных PMS от невозмущенных.

Рис. 8. Зависимость значений возмущенных РМ$, рассчитанных в ходе 100 независимых случайных испытаний с логнормально распределенными весовыми факторами и’„ важности каждого гена для активации каждого митогенетического сигнального пути, от невозмущенных значений для тех же путей

Действие не только таргетных противоопухолевых препаратов, но и, к примеру, ионизирующих излучений также изменяет активность многих клеточно-физиологических процессов. В частности, выживание клеток после облучения находится в прямой зависимости от активации репарации ДНК, а также ингибирования про-апоптоти- ческих и про-некротических реакций. Нами были исследованы последствия лучевой терапии в виде изменений в митогенетических сигнальных путях для девяти пациентов с колоректальным раком, облученных в суммарной дозе 50 Гр за 20 фракций. По истечении шести педель после лучевой терапии облученную опухоль удаляли хирургически, а уровни экспрессии различных генов исследовали с помощью установки ABI Human Genome Survey Microarray [24]. С помощью программного комплекса OncoFinder были выявлены наиболее активированные и ингибированные на шести неделях после лучевой терапии сигнальные пути. Наибольшая активация была обнаружена для апти-апоптозных путей, наибольшее ингибирование — для апоптозных, значительно усиленными оказываются также гормональные пути и каскады семейства митогеп-активированных про- теип-киназ. Результаты анализа сведены в табл. 4. Объяснить такие результаты можно тем, что только те клетки, которые обладают значительным потенциалом к подавлению апоптоза, способны выжить после такого агрессивного воздействия, как лучевая терапия.

Та б л и ца 4. Сигнальные пути больных колоректальным раком, наиболее измененные по истечении шести недель после лучевой терапин в дозе 50 Гр (статистика по девяти больным)

Была сделана проверка системы OncoFinder на наборах данных, полученных с помощью исследования транскриптома раковых клеток различными методами: с помощью микрочипового анализа РНК и РНК-секвепирования. Такие наборы данных депонированы в хранилище Gene expression omnibus (GEO).

Набор данных GE036244 [25] был получен на клетках линии HepG2, которые подвергались (или не подвергались) воздействию бенз(а)пирена — канцерогена, разрушающего ДНК. В ходе эксперимента транскриптомный профиль исследовали с помощью секвена- тора Illumina Genome Analyzer и РНК-микрочипового анализатора Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip через 12 и 24 ч после обработки бенз(а)пирепом двух копий культур клеток.

Другой набор данных, GE037765 [26], был получен на клетках образцов аденокарциномы легких, которые были обследованы с помощью двух установок: анализатора РНК-микрочипов Agilent IM CNV, а также РНК-секвенатора Illumina Genome Analyzer Их. Эксперимент был проведен на шести образцах опухолей, а также па шести образцах, взятых из морфологически интактной части легких у шести женщин с раком легкого.

Хотя такие сравнения результатов обследования транскриптома, полученные разными методами, стали часто применять в мировой практике, удовлетворительного согласия между их данными, полученными даже для одинаковых образцов, достичь удается не всегда. Например, в работах [25, 26] корреляция между этим результатами или была слабой, или практически отсутствовала.

Мы провели проверку возможности с помощью системы OncoFinder обрабатывать полнотранскриптомные массивы данных, извлекая полезную информацию из шума. Для этого с помощью программы OncoFinder были обработаны результаты, полученные в статьях [25, 26]; для них мы рассчитали патологические изменения в сигнальных путях PMS. В качестве нормальных мы использовали образцы, не подвергшиеся воздействию мутагенов и канцерогенов из работы [25], а также морфологически интактные образцы из работы [26]. Хотя в [25, 26] результаты микрочипового и секвена- торного обследования транскриптома для одинаковых образцов плохо коррелированы, после обработки программой OncoFinder они оказываются хорошо коррелированными па сигналомном уровне, т.е. для совокупности сигнальных путей (за исключением одного образца на каждый набор данных), а также в среднем по набору данных (табл. 5, 6, рис. 9, 10).

Таким образом, системно-биологический подход имеет прикладные результаты в задачах диагностики и лечения таких достаточно грубых дефектов, как развившийся рак. Что касается риска возникновения еще не развившегося рака, то для этих исследований потребуется время. Flo уже ясно, что лечение развившегося рака в идеале должно быть персонализированным. Нет никаких оснований полагать, что по-иному будет обстоять дело с риском возникновения рака. Каждый из нас несет наследство миллионов и миллиардов поколений

Табл и ца 5. Коэффициенты корреляции между данными, полученными в результате микрочипового анализа РНК и РНК-секвенированин для образцов клеток линии

НерГ.2 |27]

Рис. 9. «Облако» значении и линия тренда усредненных по четырем образцам значений PMS, рассчитанные с использованием результатов, полученных с помощью мнк- рочипового анализа, а также секвеннрования РНК для клеточной линии HepG2 |27|

Рис. 10. «Облако» значении и линия тренда усредненных по шести образцам значений PMS, рассчитанные с использованием результатов, полученных с помощью микрочи- пового анализа, а также секвеннрования РНК для клеток аденокарциномы легких у шести пациентов |28|

Табл и ца 6. Коэффициенты корреляции между данными, полученными в результате микрочипового анализа РНК и РНК-секвенирования для образцов клеток аденокарциномы легких [25]

предшествующих живых существ, большинство из которых еще не были людьми, по уже болели раком, и этот генетический груз, конечно, над нами тяготеет. Конечно, он у нас разный. Действие такого достаточно слабого канцерогена, как ионизирующее излучение, в тех дозах, которые не вызывают смерти, сильно зависит от нашей предрасположенности к заболеванию. Конечно, такой ответ о риске заболеваемости раком невозможен без подхода Галена «Лечи больного, а не болезнь», т.е. без персонализированной медицины. Что это означает? Что фактически такой порог будет индивидуально зависимым, и с медицинской точки зрения это выводит проблему оценки риска возникновения рака при облучении из домена промышленной гигиены в домен клинической профилактической/превентивной медицины, но все равно это не гигиена — это клиника. Гигиена отличается от клиники тем, что гигиена есть медицина без пациента. Гигиена работает со средним человеком. В случае риска возникновения рака при облучении, как мы уже убедились, никакого среднего человека быть не может, тут средние отклонения гораздо больше математического ожидания. Казалось бы, это повод схватиться за голову промышленным радиационным гигиенистам. К счастью, в области промышленной радиационной гигиены все не так катастрофично. Использование фактически неверной линейной беспороговой концепции привело на практике к тому, что все дозовые пределы в промышленности занижены так, что они даже для самого радиочувствительного индивида исключают повышение риска возникновения рака при работе в штатных условиях. А что касается нештатных, то их предотвращение является уже вопросом не гигиены, а технологии. А это уже вопрос той области специальности, в которой физики разбираются больше автора.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ К ЛЕКЦИИ 4

• 1. 1ЛЕА-2000а. Absorbed Dose Determination in External Beam Radiotherapy / An International Code of Practice for Dosimetry Based on Standards of Absorbed Dose to Water // Technical Reports Series No. 398. Vienna: IAEA, 2000.
• 2. ICRP Publication 103. Annals of the IC'RP. 2007. Vol. 37.
• 3. Kellcrer A.M. Fundamentals of microdosimetry / In The Dosimetry of Ionizing Radiation, eds Rase K.R., Bjarngard B.E., Attix F.H. — New-York: Academic Press, 1985. P. 77—162.
• 4. United Nations. UNSCEAR 2000. Report to the General Assembly, with Scientific Annex. United G. Biological effects at low radiation doses. — New-York, 2000. P. 73—175.
• 5. United Nations. UNSCEAR 1993. Report to the General Assembly, with Scientific Annex. Annex F. Influence of dose and dose rate on stochastic effects of radiation. United Nations. — New-York, 1993. P. 619—727.
• 6. Котеров Л.Н. Малые дозы радиации: факты и мифы. — М.: Изд-во «ФМБЦ им.А.И. Бурназяна» ФМБА России, 2010.
• 7. ICRP Publication 92. Annals of the ICRP. 2003. Vol. 33.
• 8. ICRP Publication 103. Annals of the ICRP. 2007. Vol. 37.
• 9. Barabanova A.V., Bushmanov A.Yu., Kotenko K.V. Health Effect of Chernobyl and Radioactive Material: Acute Radiation Sickness (MS number 81).
• 10. Low doses of ionizing radiation: health effects and assessment of radiation risks for emergency workers of the Chernobyl accident /Editors G.N. Souchkevitch, M.N. Repacholi / V.K. Ivanov, A.F. Tsyb. S.I. Ivanov, G.N. Souchkevitch. Geneva: World Health Organization, 2001.
• 11. Иванов B.K. Радиация и риск. 2006. Вып. 15. № 1—2. С. 11—21.
• 12. McMichacl A.J., Haynes S.G., Tyroler H.A. Evaluations of occupational mortality and morbidity data biased by the exclusion of workers lost through death or disability//J Occup Med. 1974. Vol. 16. P.458.
• 13. Muirhead C.R., Kendall G.M., Little M.P. Chronic Low Level Radiation and Mortality: Information from the UK National Registry for Radiation Workers // Радиация и риск. 1996. Вып. 8. С. 59—64.
• 14. Marshall C.J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation // Cell. 1995. Vol. 80. P. 179—185.
• 15. Signaling through receptors and scaffolds: independent interactions reduce combinatorial complexity / N.M. Borisov, N.l. Markevich, J.B. Hoek, B.N. Kholodenko // Biophys J. 2005. Vol. 89. P. 951—966.
• 16. Domain-oriented reduction of rule-based network models / N.M. Borisov, A.S. Chistopolsky, J.R. Faeder, B.N. Kholodenko // IET Syst Biol. 2008. Vol. 2. P. 342—351.
• 17. Kuzmina N.B. and Borisov N.M. Handling complex rule-based models of mitogenic cell signaling (On the example of ERK activation upon EGF stimulation) // International Proceedings of Chemical, Biological and Environmental Engineering. 2011. Vol. 5. P. 76—82.
• 18. Scaffolding protein GAB1 sustains epidermal growth factor-induced mitogenic and survival signaling by multiple positive feedback loops / A. Kiyatkin, E. Aksamitiene, N.I. Markevich et al. // J Biol Chem. 2006. Vol. 281. P. 19925— 19938.
• 19. Systems-lcvel interactions between insulin-EGF networks amplify mitogenic signaling / N. Borisov, E. Aksamitiene, A. Kiyatkin et al. // Mol Syst Biol. 2009. Vol. 5. Article No 256.
• 20. Жуков H.B., Тюляндин C.A. Целевая терапия в лечении солидных опухолей: практика противоречит теории // Биохимия. 2008. Т. 73. № 5. С. 751— 768.
• 21. OncoFindcr, a new method for the analysis of intracellular signaling pathway activation using transcriptomic data / A.A. Buzdin, A.A. Zhavoronkov, M.B. Korzinkin et al. // Frontiers in Genetics: Bioinformatics and Computational Biology, Doi: 10.3389/fgene.2014.00055.
• 22. GEO repository URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
• 23. Dataset GS.V1215422/ URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
• 24. New specific molecular targets for radio-chemotherapy of rectal cancer / K. Snipstad, C.G. Fenton, J. Kjaeve et al. // Mol. Oncol. 2010. Vol. 4. P. 52—64.
• 25. RNA-seq provides new insights in the transcriptome responses induced by the carcinogen benzo[a]pyrene /J. Van Delft, S. Gaj, J. Lienhard et al. //Toxicological sciences. 2012. Vol. 130. P. 427—439.
• 26. A high-dimensional, deep-sequencing study of lung adenocarcinoma in female never-smokers / S.C. Kim, Y. Jung, J. Park et al. // PLoS One. Vol. 8. Art. e55596.