Очистки инсулина от примесей, близких по молекулярной массе

Для очистки от примесей такого типа применяют ионообменную и аффинную хроматографию. Примесным пептидом, хроматографическое поведение которого очень близко к поведению инсулина, является А21-дезамидоинсулин — производное инсулина, содержащее в 21-м положении А-цепи аминокислотный остаток аспарагиновой кислоты вместо аспарагина. А21-дезамидоинсулин образуется наряду с инсулином при pH < 7 не только в ходе гидролиза рекомбинантного белка, но и при возможном дезамидировании инсулина.

Помимо А21-дезамидоинсулина и инсулина, во время ферментативного гидролиза образуются инсулиноподобные (родственные) полипептиды: N-карбамоилглицининсулин, N-карбамоилфенилаланининсулин, N-формилглицининсулин и т. п. Для их удаления используют обра- щенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФВЖХ) на сорбентах на основе силикагеля с привитой обращенной фазой. Сорбенты также могут быть полимерными. Суммарный выход очищенного инсулина — более 65%. ОФВЖХ может стать производственным этапом очистки, так как ее использование экономически более выгодно, чем остальные хроматографические процессы.

Для очистки инсулина от С-пептида, трипсина и карбоксипептида- зы В после ферментативного гидролиза предшественника, а также остаточных количеств проинсулина применяют ионообменную хроматографию на сульфопропильных катионообменниках. Катионообменную хроматографию также используют для окончательного удаления остаточных иммуногенных примесей. В режиме катионного обмена раствор белка наносят на хроматографический сорбент при низких (ниже изо- электрической точки инсулина) значениях pH (2-3) и при очень высоких скоростях потока (чтобы избежать волокнообразования). Элюируют инсулин, градиентно повышая содержание ионов натрия в составе подвижной фазы.

Для эффективной очистки инсулина можно использовать аффинную хроматографию на сорбенте с иммуносорбционным принципом связывания — CNBr-сефарозе, модифицированной моноклональными антителами к инсулину. Такой носитель очищает инсулин от всех примесей, кроме родственных (например, дезамидированного инсулина).

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >