Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания МУК 4.1.2204-07

/. Назначение и область применения

Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определения охратоксина А в продовольственном сырье и пищевых продуктах и предназначены для проведения лабораторных исследований учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в организациях, осуществляющих контроль безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. [1]

малорастворим в воде. При фотометрировании раствора охратоксина А в толуол-уксусной кислоте (99:1) максимум поглощения наблюдается при длине волны 333 нм, при этом относительный молярный коэффициент поглощения равен 544 м/моль.

В экспериментах in vivo показано нефротоксическое, канцерогенное, тератогенное, эмбриотоксическое, нейротоксическое и иммунотоксичес- кое действие охратоксина А. Международное агентство по изучению рака классифицирует охратоксин А как соединение, потенциально канцерогенное для человека (Группа 2В). Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам установлена величина условно переносимого недельного поступления охратоксина А с пищей — 100 нг/кг массы тела.

Охратоксин А выявляется повсеместно в качестве природного загрязнителя продовольственного и кормового зерна, кофе и какао-бобов, винограда и специй.

3. Принцип метода

Метод включает следующие этапы:

  • • экстракция охратоксина А из пробы смесью ацетонитрил—вода (60 :40% об.);
  • • очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;
  • • определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ с флуориметричес- ким детектированием при длине волны возбуждения (А.ВОЗб) 333 нм и длине волны эмиссии (Хэмис) 466 нм.

Диапазон определяемых концентраций: 0,0001—0,016 мг/кг. Предел количественного определения: 0,0005 мг/кг.

Таблица 1. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций охратоксина А в пробе

Метрологические характеристики

Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг

0,0001-0,001

>0,001

Границы относительной погрешности (показатель точности) (±5), %, Р= 0,95

±30,72

±10,92

Стандартное отклонение повторяемости (ог), %

24,56

8,78

Предел повторяемости (/•), %

68,77

24,58

Полнота извлечения веществ, %

88,80

86,28

  • 4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы
  • 4.1. Средства измерений

Система ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 с объемом петли-дозатора 50 мкл, спектрофлуо- риметрического детектора, обеспечивающего

1

возбуждение флуоресценции в спектральной области 330-340 нм и регистрацию эмиссии флуоресценции при длине волны 466 нм и системы для сбора и обработки данных типа Мультихром (Ампсрсенд. Россия) или аналогичной, хроматографической колонки (250 х 4,6 мм), заполненной силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом с размером частиц 5 мкм (например, Kromasil С18 (MetaChem Texnologies, США))

Весы аналитические Микрошприц на 100 мкл для ВЭЖХ Дозатор пипеточный, 1—5 см3 Дозатор пипеточный, 100—1000 мкл Дозатор пипеточный, 10—100 мкл Цилиндры мерные с притертой пробкой

вместимостью 100 см3 тип 2—100 и 2—250 ГОСТ 1770-74

4.2. Вспомогательное оборудование Спектрофотометр

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С ТУ 64-1 -2451

или аналогичный

Ротационный испаритель ИР-1 М с ловушкой ТУ 25-11917

или аналогичный

Электрошкаф сушильный лабораторный с

погрешностью поддержания температуры ± 2,5 ТУ 16-531.639

в интервале от 50 до 350 °С

Холодильник бытовой ГОСТ 16317

Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3 ТУ 46-22-236-79

или аналогичный pH-метр

Магнитная мешалка типа М М 5 с персмсши- ТУ 25-11.834-80

вающим стержнем

Колбы плоскодонные конические на 250 см3 ГОСТ 10394-74

с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32

Флаконы стеклянные завинчивающиеся из

темного стекла (вайл), объемом 7 см3

Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1 000 см3 ГОСТ 1770-74

тип 2-100-2, 2-500-2

Воронки лабораторные ГОСТ 25336

Колбы грушевидные на 10 см3 с НШ 14,5, тип ГОСТ 10394-72

ГрКШ-10-14/23

4.3. Реактивы и материалы

Стандарт охратоксина А, фирма Sigma, кат. №0-1877

Фильтры обеззоленные «синяя лента» ТУ 6-09-1678

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, ГОСТ 4172-76

12-водный, ч.д.а.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 245-76

2-водный, ч.д.а.

Натрий хлорид, х.ч. ГОСТ 4233-77

Ацетонитрил, о.с.ч., сорт 0

Метанол, о.с.ч. ГОСТ 6995-77

Кислота фосфорная, о.с.ч. ТУ 2612-014-00203677-97

Кислота уксусная ледяная, х.ч. ГОСТ 61-75

Толуол, ч.д.а. ГОСТ 5789-78

Иммуноаффинные колонки Ochraprep (R-Biopharm, Великобритания)

  • 5. Подготовка к выполнению измерений
  • 5.1. Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см, приливают 50 см3 смеси толуол — уксусная кислота (98 : 2% об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Дш)- Концентрацию раствора вычисляют по формуле

Далее 5 см3 стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол — уксусная кислота (98 : 2% об.) до объема 100 см3, получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см3 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около

  • 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение
  • 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого можно открывать пробки.

5.2. Приготовление фосфатного буферного раствора, pH = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 10—20 см3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения 1 месяц в холодильнике.

5.3. Приготовление смесей растворителей Толуолуксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрилвода (60: 40% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрилвода (60: 40% об.; pH = 3,0).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты доводят pH смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанолуксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения 1 месяц в темном прохладном месте.

  • 6. Отбор и подготовка проб для анализа
  • 6.1. Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

  • • «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83;
  • • «Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84;
  • • «Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88;
  • • «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70.

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2. Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1—2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1. Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см3, добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил — вода (60:40%

  • 06. ). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, pH 7,4.
  • 6.2.2. Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1—2 капли в секунду, промывают 20 см3 фосфатного буферного раствора, pH 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см смеси метанол — уксусная кислота (98 : 2% об.).

  • 7. Выполнение измерений
  • 7. 1. Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2. Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил—вода (60:40% об.; pH 3,0); скорость подвижной фазы 1,5 см3/мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

  • 8. Обработка результатов измерения
  • 8.1. Построение градуировочной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что, в свою очередь, соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

8.2. Оформление результатов

Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле

где С(охр. А) — концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг; М— масса навески для анализа, г (25,0); m — масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг; У — объем раствора для экстракции, см3 (100); V2 — объем экстракта, нанесенный на ИАК, см (10); Уз — общий объем раствора А, см3 (0,4); V4 — объем раствора А, введенный в хроматограф, см3 (0,05).

При высоких уровнях загрязнения охратоксином А пробы необходимо увеличить объем раствора А (Уз) с внесением соответствующих изменений в формулу.

За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:

Результат анализа представляют в виде (при вероятности Р = 0,95):

где Д — граница абсолютной погрешности:

8 — граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина А в пробе меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание охратоксина А в пробе зерна менее 0,0001 мг/кг»[2]

8.3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (г) (табл. 1):

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

то среднее арифметическое принимают за результат анализа. При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

9. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50—100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (охр.А)) и пробы с добавкой (С'(ОХр.А)). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов,растворов и т.д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой '(охр.а»), пробы без добавки (С(охр.А)) и величиной добавки (Сдоб(охр А)) с нормативом оперативного контроля (К). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р= 0,95):

Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле (Р = 0,90)

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

10. Условия выполнения измерений

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.

Относительная влажность воздуха не более 80% при 25 °С.

Атмосферное давление 730—760 мм рт. ст.

Напряжение электропитания 210—220 В.

Частота переменного тока 45—50 ГЦ.

Комплекс экоаналитических методик определения микотоксинов в пищевых продуктах и напитках был разработан с использованием хроматографов (ВЭЖХ/ионный) «Стайер». Аттестованные методики этого ряда перечислены в табл. 11.14.

Нормативный документ

Определяемый компонент

Диапазон измерения

Объект испытаний: пищевые продукты

ФР.1.31.2004.01033 Свидетельство № 87-05 от 28.12.05

Методика выполнения измерений массовой доли бенз(а)пирена в пищевых продуктах, продовольственном сырье, пищевых и вкусовых добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Бснз(а)пнрен

от 0,0005 до 0.002 вкл. млн 1 (мае. доли)

ФР. 1.34.2005.01731 Свидетельство № 59-04 от 14.10.04

Методика выполнения измерений массовой концентрации афлатоксина М| в молоке, молочных продуктах и масле коровьем методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Афлатоксин М|

от 0,25 до 2,5 вкл. (мг/кг)

Свидетельство № 76-05 от 05.12.05

Лизин

от 1000 до 20000 млн-1 (мг/кг)

Методика выполнения измерений массовой доли лизина,

Триптофан

от 1000 до 20000 млн~‘ (мг/кг)

триптофана, метионина, суммы цистина и цистеина в

Метионин

от 1000 до 20000 млн-1 (мг/кг)

комбикормах, премиксах и комбикормовом сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сумма

(Цистин+Цистеин)

от 1000 до 5000 млн-1 (мг/кг)

Свидетельство № 77-5 от 05.12.05

в,

от 0,0025 до 0,010 вкл. (мг/кг)

Методика выполнения измерений массовой доли

в2

от 0,0025 до 0,010 вкл. (мг/кг)

афлатоксинов Вь В2, Gi, Gi в пищевых продуктах

Gi

от 0,005 до 0,02 вкл. (мг/кг)

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

G2

от 0,0005 до 0,0010 вкл. (мг/кг)

Свидетельство № 11-06 от 16.05.06

Методика выполнения измерений массовой доли зеаратенона в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Зеараленон

от 0,10 до 0,8 вкл. (кг/кг)

Свидетельство № 11-06 от 16.05.06

Методика выполнения измерений массовой доли дезоксиниватенола в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Дезоксиниваленол

от 0,35 до 2,0 вкл. (мг/кг)

Класс веществ

Матрица

Подготовка

Условия разделения

Афлатоксины G2,G,. В,,

Вь М2, М|

Орехи, пряности, корм для животных, молоко, молочные продукты

Экстрагирование согласно [133]

Колонка Hypersil ODS (100 х 2,1 мм; размер частиц 3 мкм)

Изократическое разделение; состав подвижной фазы: смесь воды, метанола и ацетонитрила (63:26:11) Скорость протока: 0,3 мл/мин при 25 ’С

Детектор с диодной матрицей: обнаружение на длине волны 365 нм при ширине полосы 20 нм Флуориметрический детектор: возбуждающая длина волны 365 нм; возбужденная длина волны 455 нм

Охратоксин А

Хлебные злаки, мука, инжир

Экстрагирование согласно |133|

Подкисление HCI

Экстрагирование толуолом Очистка на колонке с силикагелем; элюирование смесью толуола с уксусной кислотой (9:1)

Колонка Lichrospher 100 RP18 (120 х 4 мм; размер частиц 5 мкм) Подвижная фаза: смесь воды, содержащей 2% уксусной кислоты, и ацетонитрила (1:1)*

Флуориметрический детектор: возбуждающая длина волны 347 нм; возбужденная длина волны 480 нм

Зеараленон

Хлебные злаки

Экстрагирование толу- лом

Очистка на патроне Seppak

Элюирование смесыо толуола с ацетоном (95:5)

Подготовка к анализу а- зеараленола и зеаралено- на в кукурузе согласно АОАС 985 J 8 [ 134]

Колонка Hypersil OD (100 х 2,1 мм; размер частиц 3 мкм)

Изократическое разделение; состав подвижной фазы: смесь воды, метанола и ацетонитрила (5:4:1 )*

Скорость протока 0,49 мл/мин при 45 °С

Детектор с диодной матрицей: обнаружения на длине волны 236 нм при ширине полосы 464 нм

Патулин

Продукты из яблок

Очистка на патроне Extrelut

Очистка на колонке с силикагелем

Элюирование смесью толуола с этилацетатом (3:1)

Колонка Superspher RP18 (128 х 4 мм; размер частиц 4 мкм)

Смесь воды с ацетонитрилом

(5%:95%)

Скорость протока 0,6 мл/мин при 40 °С

Детектор с диодной матрицей: обнаружение на длине волны 270 нм при ширине полосы 20 нм или

Колонка Lichrospher DIOL (125 х 4 мм; размер частиц 5 мкм)

Изократическое разделение; состав подвижной фазы: смесь гексана с изопропанолом (95:5)

Скорость протока 0,6 мл/мин при 30 "С

Детектор с диодной матрицей: обнаружение на длине волны 270 нм при ширине полосы 20 нм

* Колонку рекомендуется регенерировать чистым ацетонитрилом.

В табл. II. 14-А приведены краткие характеристики ВЭЖХ-методик определения микроколичеств микотоксинов в пищевых продуктах [2]. Как следует из этой таблицы, методики США, выполняемые методом ЖЭ/ТФЭ/ВЭЖХ/УФ или ФлД, аналогичны российским методикам (разд. 5) [442].

  • [1] Общие положения Охратоксин А — микотоксин, продуцируемый микроскопическими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Основными продуцентами охратоксинаА являются A. ochraceus и Р. verrucosum. Охратоксин A (C2oYiSC1N06, молекулярная масса 403,8), представляющий собой по химической структуре 5-хлоризокумарин, связанныйпептидной связью с L-фенилаланином, хорошо растворим в полярных органических растворителях и водном растворе гидрокарбоната натрия,
  • [2] 0,0001 мг/кг — предел обнаружения.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >