Методика выполнения измерений массовой доли бенз(а)пирена в продовольственном сырье, пищевых продуктах и почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Назначение и область применения

Методика предназначена для количественного определения бенз(а)пирена (БП) в продовольственном сырье, пищевых продуктах и почве при его массовой доле, указанной в табл. 1. Нижняя граница диапазона измерений соответствует 1/2 допустимого уровня (содержания) токсина в продуктах и сырье, верхняя граница — пятикратному превышению допустимого уровня.

Бенз(а)пирен — высокотоксичное канцерогенное соединение, и его допустимое содержание в пищевых продуктах и продовольственном сырье устанавливается Санитарными правилами и нормами СанПиН 2.3.2.560-96.

Методика может быть применена учреждениями Госсанэпиднадзора РФ, лабораториями других организаций и предприятий, связанными с исследованиями, химическим анализом и сертификацией продуктов питания. Методика не является арбитражной.

ПАУ: стандартный раствор ЕРА 610 и проба мидии [78]

Рис. 11.14. ПАУ: стандартный раствор ЕРА 610 и проба мидии [78]

  • 1. Нафталин 9. Хризен (0,17*)
  • 2. Аценафтен (1,40*) 10. Бенз(а)пирен
  • 3. Флуорен (2,60*) 11. Бенз(Ь)флуорантен (0,26*)
  • 4. Фенантрен *2,40*) 12. Бенз(к)флуорантен (0,10*)
  • 5. Антрацен (0,13*) 13. Бенз(а)пирен (0,2*)
  • 6. Флуорантен (0,74*) 14. Дибенз(а,Ь)антрацен
  • 7. Пирен (0,67*) 15. BeH3(g,h,i)nepHaen (0,21*)
  • 8. Бенз(а)антрацен (0,07*) 16. Индено(1,2,3-сс1)пирен (0,26*)

Условия анализа:

Колонка: Supelcosil® LC РАН (250 мм х 2,1 мм; 5 мкм);

Градиент: Ацетонитрил (А) 50-100%, вода (В) 50-0%; 200 мкл/мин Температура: 25 °С Объем пробы: 10 мкл Детектирование: СФлу, по программе

Характеристики погрешности измерений

Границы относительной погрешности (±5) результата измерения массовой доли БП (при доверительной вероятности 0,95) указаны в табл. 1.

Таблица 1. Анализируемые объекты, диапазоны и характеристики измерений

Группа продуктов (анализируемый объект)

Допустимое содержание (IVX), мг/кг

Диапазон измерений массовой доли БП, мг/кг

Коэффициент

извлечения,

R

Границы относительной погрешности (±8), %

Копченые мясные, рыбные и жировые продукты

0,001

0,0005-0,005

0,75

25

Зерно

0,001

0,0005-0,005

0,85

25

Почва

0,02

0,01-0,10

0,85

25

Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

Средства измерений

Хроматографы жидкостные:

  • — Микроколоночный «Милихром-5», ТУ 25-7405.0009-89, исполнение 3 с флуориметрическим (ФлД) детектором (Вариант 1).
  • — Изократический или градиентный жидкостный хроматограф, например «Кпаиег» (Германия), Госреестр средств измерений РФ 16848-97 или Приставка хроматографическая «ВЭЖХ-3», ТОО «Лю- мэкс» (С.-Петербург), снабженные ФлД «Флюорат-02-2М», ТОО «Люмэкс», Госреестр средств измерений РФ 14093-99 (Вариант 2).
  • — Изократический или градиентный жидкостный хроматограф с ФлД любого типа, например «Кпаиег» (Германия), Госреестр средств измерений РФ 16848-97 (Вариант 3).

Колонки хроматографические «Диасфер-110-С 16», ТУ 4215-001- 05451931-94, ЗАО «БиоХимМак СТ» (Москва), с типоразмерами, соответствующими варианту хроматографической системы:

  • — 2 х 80 мм, dp = 5 — 7 мкм (Вариант 1)
  • — 2 х 150 мм, dp = 5 — 7 мкм (Вариант 2)
  • — 4 х 150 мм, dp = 5 — 7 мкм (Вариант 3)

Программно-аппаратный комплекс «МультиХром-Спектр», ТУ АЖРЦ

3.036.001, ЗАО «Амперсенд» (Москва), либо любое другое программное обеспечение, позволяющее проводить градуировку и количественное определение методом внешнего стандарта.

ГСО 7515-98 состава раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле с массовой концентрацией бенз(а)пирена 100 мкг/см3, АОЗТ «Экрос» (С.-Петербург).

ГСО 7064-93 состава раствора бенз(а)пирена в гексане с массовой концентрацией бенз(а)пирена 100 мкг/см3, АОЗТ «Экрос» (С.-Петербург).

Весы лабораторные электронные 4 кл. точности модели ВЛЭ 134, ГОСТ 24104-88 илидр.

Микрошприцы вместимостью 100 мкл фирмы Hamilton, модель Microliter #1710 или аналогичные.

Микропипетки 0,5; 0,2; 0,1 мкл; ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные 2-25,2-50, 2-100 и 2-500, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные 2-10-2, 2-100-2, ГОСТ 1770-74.

Пипетки градуированные 1, 2, 5, 10 см3, ГОСТ 29227-91.

Реактивы и материалы

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ОП-3 осч, ТУ 6-09-14- 2167-84, ректифицированный.

Вода бидистиллированная, ТУ 6-09-2502-77.

Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78, высушенный над Na2S04, ректифицированный.

Бензол, х.ч., ГОСТ 5955-75, высушенный над Na2S04, ректифицированный.

Сульфат натрия безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Концентрирующие патроны «Диапак»: А-3, П-3, С; ТУ 4215-002- 05451931-94, ЗАО «БиоХимМак СТ» (Москва).

Вспомогательные устройства

Система для фильтрации и дегазации элюентов ЗАО «БиоХимМак СТ» (Москва) или др.

Стеклянные флаконы для градуировочных и анализируемых растворов вместимостью 1,8 и 5,0 см3 с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками фирмы Supelco, номера по каталогу 2-6951, 2-7037 и

2-7039, или аналогичные.

Микросмеситель ППЭ-3, «Экрос» (С.-Петербург).

Испаритель ротационный ИР-1М2, ТУ 25-1173.102-84 или др.

Колбы остродонные с пробками вместимостью 25, 10 и 5 см3, ГОСТ 25336.

Устройство для отдувки растворов в токе азота, снабженное термоста- тируемым алюминиевым блоком (суховоздушной баней) СП «БиоМарк» (Львов) или др.

Мембранные фильтры с dp = 0,4—0,5 мкм.

Устройство для создания вакуума около 7 мм рт. ст. (водоструйный насос, ГОСТ 25336; водокольцевой вакуумный насос «Бегемот», УВК-РК2/1, ЗАО «БиоХимМак СТ», Москва).

Вакуумное устройство для подготовки проб (вакуумный манифолд) или др. с приемниками проб вместимостью не менее 10 см3.

Колба Бюхнера, воронка Бунзена вместимостью не менее 500 и 200 см3 соответственно, ГОСТ 1770.

Воронка делительная вместимостью 100 и 500 см3, ГОСТ 25336.

Колбы плоскодонные конические с пробками вместимостью 50, 100 и 250 см3, ГОСТ 25336.

Колбы грушевидные с пробками вместимостью 50 и 100 см3, ГОСТ 25336.

Воронка коническая диаметром не менее 10 см, ГОСТ 1770.

Бумага фильтровальная типа «синяя лента».

Вата медицинская нестерильная, х/б.

Метод измерений

Методика включает следующие основные процедуры:

  • — первичная экстракция гексаном и переэкстракция в ацетонитрил БП из пробы копченого продукта;
  • — первичная экстракция БП смесью ацетонитрил—вода из пробы зерна или почвы;
  • — концентрирование и очистка первичного экстракта методом твердофазной экстракции;
  • — разбавление подготовленного экстракта пробы смесью ацетонитрил—вода;
  • — градуировка хроматографа по растворам с известным значением массовой концентрации БП;
  • — анализ раствора подготовленного экстракта пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с регистрацией сигнала флуоресценции;
  • — идентификация определяемого БП по параметрам удерживания;
  • — вычисление массовой концентрации БП на основе зарегистрированного аналитического сигнала и градуировочной характеристики;
  • — вычисление массовой доли БП, исходя из массовой концентрации БП, массы пищевой пробы и объема раствора подготовленного экстракта.

Требования безопасности

При работе с используемыми химическими соединениями необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, ГОСТ 12.1.018-86 и ГОСТ 12.1.004-76, требования пожарной безопасности, ГОСТ 12.1.004-76.

При попадании растворов БП на кожу' или поверхности предметов необходимо обработать их водой с моющим средством, а затем этиловым спиртом. Растворы должны храниться в холодильнике в герметичной упаковке.

При эксплуатации системы для ВЭЖХ и проведении соответствующих измерений необходимо соблюдать правила электробезопасности, ГОСТ

12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации операторов

К работе допускаются лица:

  • — имеющие квалификацию инженера-химика или техника-химика;
  • — имеющие опыт работы в химической лаборатории;
  • — прошедшие соответствующие курсы обучения и стажировку в лабораториях, аккредитованных на выполнение анализов с применением ВЭЖХ;
  • — получившие положительные результаты при выполнении контрольных операций.

Условия выполнения измерений

Подготовку проб, приготовление растворов, подготовку и выполнение измерений проводят при температуре окружающего воздуха 18—25 °С, атмосферном давлении 84,0—100,7 кПа (630—800 мм рт. ст.), влажности воздуха не более 80% (при температуре 25 °С).

При измерениях в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия: напряжение в сети 220±10 В, частота тока в сети 50zh 1 Гц. Измерения проводят в условиях, рекомендуемых описанием и инструкцией по эксплуатации прибора.

Подготовка к выполнению измерений

Стеклянная посуда

Использованную стеклянную посуду перед дальнейшим употреблением ополаскивают последним из применявшихся растворителей и тщательно моют горячей водой с любым моющим порошком, ополаскивают последовательно дистиллированной и бидистиллированной водой и сушат. Чистую посуду хранят, закрыв пробкой или ватным тампоном.

Отбор проб, хранение и обращение с ними

Отбор и усреднение проб проводят в соответствии с нормативными документами на каждый вид продукции (ГОСТ 13586.3-83, ГОСТ 27668-88, ГОСТ 9792-73, ГОСТ 7631-85). Определяемый БП извлекают из проб копченых продуктов экстракцией сухим гексаном, после упаривания которого проводят его переэкстракцию в ацетонитрил. При извлечении БП из проб зерна или почвы используют смесь вода—ацетонитрил (16:84). Последующие концентрирование и очистку первичного экстракта пробы, содержащего БП, вне зависимости от характера исходного продукта выполняют в соответствии с комплексной схемой твердофазной экстракции с использованием трех концентрирующих патронов Диапак А-3, П-3, С.

Подготовленные пробы (экстракты проб) растворяют в смеси ацетонитрил—вода (70:30).

Каждое измерение массовой доли БП включает подготовку и хроматографический анализ не менее двух проб.

Приготовление смесей растворителей

Смеси растворителей готовят объемным методом в мерных цилиндрах. Требуемые объемы ацетонитрила и воды отмеряют отдельными мерными цилиндрами, а затем смешивают. Экстрагент А: смесь ацетонитрил—вода (84:16).

Приготовление экстрагентов

Для приготовления взаимнонасыщенных ацетонитрила и гексана в делительной воронке вместимостью 500 см3 встряхивают около 300 см3 ацетонитрила и 100 см3 гексана. После расслоения растворителей раздельно отбирают слои: нижний (ацетонитрил, насыщенный гексаном, — экстрагент Б) и верхний (гексан, насыщенный ацетонитрилом, — экстрагент В), интерфазу отбрасывают.

Приготовление элюентов

Для проведения измерений методом ВЭЖХ готовят смеси ацетонитрил—вода в следующих соотношениях: (90:10) — элюент 90, (84:16) — элю- ент 84, (80:20) — элюент 80, (70:30) — элюент 70. Готовые элюенты фильтруют через мембранный фильтр и проводят вакуумную или термическую дегазацию.

Приготовление градуировочных растворов

ГСО состава раствора БП в ацетонитриле (см. выше) перед использованием разбавляют смесью ацетонитрил—вода (7:3). Пипеткой отбирают

1,0 см3 исходного раствора, помешают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и добавляют растворитель до метки. Далее пипеткой отбирают определенные объемы полученного раствора, помешают их в мерную колбу вместимостью 10 см3 и добавляют растворитель до метки. Соответствующие объемы растворов, используемых для разбавления, и концентрации градуировочных растворов 2—5 (Вариант 1) и 3—7 (Варианты 2, 3) указаны в табл. 2. При использовании ГСО состава раствора БП в гексане (см. ниже) после упаривания растворителя в условиях, приведенных ниже, сухой остаток перерастворяют в ацетонитриле и разбавляют, как описано выше, с учетом значения аттестованной концентрации ГСО.

Таблица 2. Растворы для градуировки при анализе бензопирена (БП)

Массовая концентрация БП (аттестованное значение ГСО), мкг/см3

Исходный раствор для разбавления

Градуировочный

раствор

Объем,

см3

Массовая концентрация БП, мкг/см3

100

1,0

ГСО

1*

1,0

2,0

1

2

0,2

1,0

1

3

0,1

0,5

1

4

0,05

0,25

1

5

0.025

0.10

1

6

0,010

0,05

1

7

0.005

*Не используется для непосредственной градуировки хроматографической системы.

Подготовка хроматографической системы

Хроматограф включают и подготавливают к работе в соответствии с его описанием и руководством к эксплуатации. Устанавливают колонку «Диасфер-110-С 16» с типоразмерами в соответствии с вариантом хроматографа (см. выше). Прокачивают через хроматографическую систему элюент с наибольшей концентрацией ацетонитрила до стабилизации базовой линии детектора, а затем кондиционируют ее в начальных условиях градиента по соответствующим разделам «Условия проведения анализа».

Подготовка концентрирующих патронов

Концентрирующие патроны Диапак А-3 и П-3 подготавливают к работе следующим образом:

  • 1. В полипропиленовый корпус объемом 10 см3 со сменным фильтром в нижней части засыпают 3 см3 сухого сорбента Диапак А или П. Верхнюю пустую часть корпуса используют в качестве воронки для нанесения пробы или элюента.
  • 2. Закрепляют патрон вертикально в подходящем устройстве для вакуумирования и формируют постукиванием ровный горизонтальный верхний слой сорбента. Для окончательной подготовки патрона Диапак А-3 достаточно зафиксировать слой сорбента небольшим ватным тампоном.
  • 3. Для подготовки патрона Диапак П-3 сорбент промывают последовательно 10 см3 бензола, ацетона и экстрагента А при слабом вакуумировании (скорость скапывания не более 1—2 капель в секунду), не допуская попадания воздуха на сорбент. После заполнения патрона ацетоном дают сорбенту отстояться, вводят верхний полимерный фильтр, уплотняют его по верхнему слою сорбента и продолжают промывку. При достижении экстрагентом А уровня 2—3 см над фильтром промывку прекращают и патрон укупоривают нижней заглушкой и верхней крышкой (для хранения). При случайном пересыхании патрон промывают экстрагентом А. Перед нанесением пробы заглушки снимают и при слабом вакуумировании пропускают остатки водно-ацетонитрильной смеси до уровня верхнего фильтра, затем немедленно заливают исследуемый раствор. Регенерацию многоразового патрона Диапак П-3 проводят по аналогичной схеме, исключая извлечение верхнего фильтра.

Концентрирующий патрон Диапак С подготавливают к работе следующим образом:

  • 1. Готовая полипропиленовая капсула с 1 см3 сорбента Диапак С укупорена заглушками. После снятия заглушек патрон подготавливают к работе, пропуская через него при помощи шприца 5 см3 гексана при скорости скапывания 1—2 капли в секунду.
  • 2. Пробу наносят самотеком, используя в качестве воронки пустой полипропиленовый корпус объемом 10 см3, плотно закрепленный в верхнем штуцере капсулы Диапака С.

Подготовка пробы к измерениям

Экстракция гексаном бенз(а)пирена из пробы копченого продукта Навеску 10,0 г пробы копченого продукта растирают в ступке с 30 г безводного сульфата натрия. Смесь количественно переносят в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3 и экстрагируют гексаном в объеме 40 см3 в течение не менее 30 мин при перемешивании. Первичный гексановый экстракт суммарного жира пробы декантируют и пропускают через 10 г безводного сульфата натрия в отгонную колбу. Дважды повторяют процедуру экстракции двумя объемами по 20 см3 гексана и пропускают порции экстракта через осушитель в ту же отгонную колбу. Упаривают гексан на ротационном испарителе при температуре не выше 35 °С до исчезновения запаха.

Экстракт суммарного жира растворяют в 20 см3 экстрагента В, количественно переносят в мерный цилиндр вместимостью 50 см3 и доводят объем раствора до 40,0 см3 тем же растворителем.

20,0 см3 полученного раствора переносят в делительную воронку вместимостью 100 см3 и проводят переэкстракцию БП в ацетонитрил тремя объемами по 20 см3 экстрагента Б. Каждый раз, добиваясь по возможности более полного разделения фаз, отбирают нижний слой (ацетонитрильный экстракт БП) и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С до объема 10—15 см3. Количественно (при помощи ацетонитрила) переносят раствор в мерный цилиндр вместимостью 25 см3, доводят объем до 21,0 см3 ацетонитрилом, добавляют 4,0 см3 бидистиллированной воды и тщательно перемешивают полученный водно-ацетонитрильный экстракт БП.

Экстракция бенз(а)пирена из пробы зерна или почвы смесью ацетонитрил-вода

Навеску 10—25 г пробы переносят в плоскодонную колбу, добавляют 50—125 см3 экстрагента А, строго соблюдая соотношение 1:5 навески продукта к объему экстрагента, и перемешивают в течение 1 часа. Фильтруют водно-ацетонитрильный экстракт БП через бумажный фильтр на воронке Бюхнера под вакуумом и отжимают осадок на фильтре.

Предварительная очистка и концентрирование первичного экстракта зерна или копченого продукта

Пропускают через патрон Диапак А-3 25,0 см3 водно-ацетонитрильного экстракта БП, а затем 3 см3 экстрагента А при скорости скапывания 2—3 капли в секунду в приемную колбу.

Пропускают через подготовленный патрон Диапак П-3 собранный элюат, а затем 5 см3 ацетонитрила при скорости скапывания 1—2 капли в секунду, отбрасывая смывы. Элюируют с патрона целевую фракцию, содержащую БП, смесью бензол—ацетонитрил (1:1) в объеме 7 см3 при скорости скапывания 1—2 капли в секунду в отгонную колбу. Упаривают элюат на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С, добавляют в колбу 0,5 см3 гексана и тщательно встряхивают на микросмесителе до полного растворения сухого остатка.

Предварительная очистка и концентрирование первичного экстракта почвы

Пропускают через патрон Диапак А-3 5,0 см3 водно-ацетонитрильного экстракта БП, затем 3 см3 экстрагента А при скорости скапывания 2—3 капли в секунду в приемную колбу. Переносят элюат в мерный цилиндр вместимостью 25 см3, ополаскивают колбу двумя объемами по 5 см3 экстрагента А и доводят объем раствора в цилиндре до 20 см3.

Пропускают через подготовленный патрон Диапак П-3 5,0 см3 разбавленного элюата, а затем 5 см3 ацетонитрила при скорости скапывания 1—2 капли в секунду, отбрасывая смывы. Элюируют с патрона целевую фракцию, содержащую БП, смесью бензол—ацетонитрил (1:1) в объеме 7 см3 при скорости скапывания 1—2 капли в секунду в отгонную колбу. Упаривают элюат на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С, добавляют в колбу 0,5 см3 гексана и тщательно встряхивают на микросмесителе до полного растворения сухого остатка.

Тонкая очистка экстракта

Наносят на подготовленный патрон Диапак С самотеком 0,5 см3 раствора пробы в гексане, затем обмывают колбу двумя порциями по 0,5 см3 гексана и последовательно наносят их на патрон, отбрасывая все смывы. Элюируют БП бензолом в объеме 2,0 см3 со скоростью скапывания 1—2 капли в секунду в отгонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50 °С. Растворяют сухой остаток экстракта пробы БП в смеси ацетонитрил—вода (7:3), объемы которой указаны в разделах «Условия проведения измерения» для каждого варианта хроматографической системы (см. ниже).

Градуировка и выполнение измерений

Градуировка хроматографа

Градуировку хроматографа осуществляют последовательным вводом (в условиях проведения измерения БП) номинального объема градуировочных растворов (табл. 2) в порядке возрастания их массовых концентраций. Каждый раствор вводят в хроматограф не менее двух раз. При правильной настройке хроматографической системы высота пика на хроматограмме градуировочного раствора с наименьшей концентрацией должна превышать уровень шумов базовой линии не менее чем в 10 раз.

После математической обработки хроматограмм фиксируют параметры удерживания и площади пиков и строят градуировочные характеристики (ГХ), отражающие зависимость среднего значения площади пика от массовой концентрации БП в градуировочном растворе[1].

Контролируют правильность построения градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику перестраивают при смене колонок, после проведения ремонтно-профилактических работ, при отрицательных результатах контроля стабильности ГХ (см. ниже).

Определение бенз(а)пирена

Условия проведения измерения (Вариант 1)

Для анализа подготовленный экстракт пробы БП растворяют в 0,1 см3 смеси ацетонитрил—вода.

Режимы работы ФМД и УВПА задают с клавиатуры ЭВМ в соответствии с Руководством пользователя (ПАК «МультиХром-Спектр») и контролируют на мониторах в следующем виде:

Флуориметрический детектор

  • • длина волны возбуждения 296 нм;
  • • длина волны испускания — светофильтр № 2 (более 380 нм);
  • • время измерения 0,2 с.

Автоматический дозатор

  • • объем регенерации 0,4 см3;
  • • объем пробы 0,04 см3;
  • • скорость потока 0,15 см3/мин;
  • • скорость набора 0,3 см3/мин;
  • • время удерживания БП 11 мин.
  • • состав элюентов в сосудах и схема составления градиента ацетонитрила представлена в табл. 3.

Таблица 3. Элюенты

Элюент 90

Элюент 84

Элюент 80

Элюент 70

№ сосуда для элюента

1

2

3

4

Объем элюента (см3)

600

600

600

700

Условия проведения измерении (Вариант 2)

Для анализа подготовленный (см. выше) экстракт пробы БП растворяют в 0,5 см3 смеси ацетонитрил—вода.

  • • фильтр на линии возбуждения — «Х4»;
  • • фильтр на линии эмиссии — «ХЗ»;
  • • объем пробы 0,02 см3;
  • • чувствительность средняя;
  • • сглаживание — 4;
  • • уровень «фона» выбирают по результатам регистрации пробной хроматограммы градуировочного раствора № 3.

Изократический режим разделения:

  • • скорость потока 0,2 см3/мин;
  • элюент 84;
  • • время удерживания БП около 12 мин.

Градиентный режим разделения:

  • • скорость потока 0,25 см3/мин;
  • • линейный градиент от 30 до 70% элюента 100в элюенте 70за 20 мин;
  • • время удерживания БП около 14 мин.

Условия проведения измерении (Вариант 3)

Для анализа подготовленный экстракт пробы БП растворяют в 0,5 см3 смеси ацетонитрил—вода.

  • • длина волны возбуждения 375 нм;
  • • длина волны эмиссии 405 нм;
  • • скорость потока 0,8 см3/мин;
  • • объем пробы 0,02 см3;
  • • постоянная времени 1,0 с.

Изократический режим разделения:

  • элюент 84;
  • • время удерживания БП около 12 мин;

Градиентный режим разделения:

  • • линейный градиент от 30 до 70% элюента 100в элюенте 70за 20 мин;
  • • время удерживания БП около 14 мин.

Получение и обработка хроматограмм

Ввод в хроматограф раствора экстракта пробы осуществляют два раза. Идентификацию БП проводят на основании сравнения параметров удерживания пиков на хроматограммах экстракта пробы и градуировочных растворов. Ориентировочные параметры удерживания указаны в разделах «Условия проведения измерений». Надежной идентификации определяемого соединения соответствует разность значений параметров удерживания для градуировочного раствора и пробы, не превышающая 0,2 мин.

Разбавление раствора экстракта

Проводят в том случае, если массовая концентрация определяемого БП превышает его наибольшую массовую концентрацию в градуировочных растворах. Раствор экстракта разбавляют вдвое (степень разбавления, dil = 2), отбирая равные объемы данного раствора и смеси ацетонитрил—вода (70:30) и смешивая последние. В том случае, если однократное разбавление не избавляет от «зашкаливания», процедуру повторяют (степень разбавления, dil = 4).

Обработка результатов измерений

Вычисляют среднее значение площади пика (выходного сигнала хроматографа) для двух вводов раствора экстракта пробы в хроматограф. Контролируют сходимость выходных сигналов (см. ниже).

По градуировочной зависимости находят значение массовой концентрации БП в растворе, соответствующее среднему значению площади пика.

Массовую долю БП (И^), мг/кг, в /-ой пробе (результат определения) вычисляют по формуле

где Сбп — массовая концентрация определяемого вещества в растворе экстракта /-ой пробы БП, мкг/см3 (вычисляется по градуировочной зависимости, исходя из среднего значения площади пика); Vp — объем раствора экстракта /-ой пробы БП, см3; R — степень извлечения БП на стадии пробо- подготовки по табл. 2; Мэкв — масса части пробы, соответствующая доле водно-ацетонитрильного экстракта БП, использованной для очистки и последующего хроматографического определения — эквивалентная масса пробы, составляющая 5,0 г (зерно, копченые продукты) или 0,25 г (почва).

В случае разбавления экстракта (см. выше) массовую долю БП (W,-, мг/кг) в /-ом измерении вычисляют по формуле

где Wj — значение, полученное по формуле (II. 1), dil — степень разбавления (см. выше).

Вычисляют среднее для двух проб значение массовой доли БП (результат анализа):

Контролируют сходимость результатов определений массовой доли БП (см. ниже).

Оформление результатов измерений

Результат анализа (измерения) массовой доли БП в определяемом объекте представляют в форме

где W — массовая доля БП, рассчитанная по формуле (II.3).

В случае, если БП не обнаружен, результат измерения представляют в форме

где П'дс — допустимое содержание БП по табл. 1.

Контроль погрешности МВИ

Контроль сходимости выходных сигналов хроматографа

Контроль проводят при градуировке и анализе каждой пробы в отношении выходных сигналов (значений площадей пиков БП на хроматограммах), полученных при двух вводах раствора в хроматограф. Результат контроля признают удовлетворительным, если размах выходных сигналов, отнесенный к среднему арифметическому, не превышает 8%.

Контроль правильности построения градуировочной характеристики

Контроль проводят при каждой градуировке. Результат контроля признают удовлетворительным при выполнении для каждогоу'-го градуировочного раствора условия

где Sj — среднее значение площади пика БП дляу'-го градуировочного раствора, у.е.; S) — значение площади пика, соответствующее по градуировочной характеристике массовой концентрации БП в у'-ом градуировочном растворе, у.е.

Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль проводят ежедневно перед началом работы с анализируемыми пробами по контрольному раствору, в качестве которого используют градуировочный раствор с массовой концентрацией БП, соответствующей его допустимому содержанию в анализируемом объекте.

Результат контроля признают удовлетворительным при выполнении условия

где Ски — значение массовой концентрации БП в контрольном растворе, найденное по градуировочной характеристике для среднего значения площади пика, мкг/см3; Ск — значение массовой концентрации БП в контрольном растворе согласно табл. 2.

Контроль сходимости результатов определения

Контроль проводят при каждом анализе (измерении). Результат контроля признают удовлетворительным, если размах результатов определений, отнесенный к среднему арифметическому (результату анализа), не превышает 10%.

Контроль погрешности методом добавок

Контроль проводят:

  • а) перед началом применения настоящей МВИ — в обязательном порядке;
  • б) при появлении сомнительных результатов определения массовой доли БП;
  • в) в соответствии с планами внутрилабораторного контроля;
  • г) по требованию организаций, контролирующих деятельность лаборатории.

Добавка формируется на основе градуировочного раствора. Величина добавки (D, мг/кг) выбирается такой, чтобы массовая доля БП в пробе увеличилась в 1,5—2,5 раза. Расчет проводят по формуле

где CD — массовая концентрация БП в градуировочном растворе, мкг/см3; Vo — объем градуировочного раствора БП, вводимого в пробу, см3; Мжв — эквивалентная масса пробы, взятой на анализ, г.

Добавка вводится в первичный экстракт пробы зерна или почвы в виде градуировочного раствора, приготовленного в соответствии с табл. 2. В первичный экстракт копченого продукта добавка вводится в виде раствора аналогичной концентрации в гексане. Для этого ГСО состава БП в гексане (см. выше) разбавляют (с учетом поправки на аттестованное значение концентрации) в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. выше), используя в качестве растворителя гексан и получая раствор требуемой концентрации. При использовании ГСО состава БП в ацетонитриле после упаривания растворителя сухой остаток перерастворяют в гексане и разбавляют гексаном, как описано выше.

Анализ двух проб с естественным содержанием БП и двух проб с добавкой БП проводят в одинаковых условиях (один прибор, одна градуировочная характеристика, один оператор). Результат контроля признают удовлетворительным при выполнении условия

6< 100(^0— W— D)/D<8 (II.7)

где WD — массовая доля БП в пробах с добавкой, мг/кг; W — массовая доля БП в пробах без добавки, мг/кг (WD и W— средние значения массовой доли для двух проб при положительных результатах контроля сходимости).

Иллюстрацией применения этой методики в практической экоаналитике могут служить хроматограмма и градуировочный график для определения бенз(а)пирена в пищевых продуктах (рис. 11.15 и 11.16).

Результаты контроля погрешности определения бенз(а)пирена в объектах методом добавок с флуориметрическим детектированием 375 Ех/405 Ет (Вариант 3).

Уровень добавки соответствует 0,5 допустимого содержания бензапирена (0,0005 мг/кг — зерно и копченые продукты, 0,01 мг/кг — почва).

Пример градуировочной зависимости для определения бенз(а)пирена [81]

Рис. 11.15. Пример градуировочной зависимости для определения бенз(а)пирена [81]

Градуировка для компонента: БаП Коэффициент корреляции: 0,999667 Отклик: Площадь

Опорный канал 365 Ех/405 Em

Формула Y = Ki • X

Точка

Высота

Площадь

Конц.

1

34.11

451,5

0.005

2

34.61

462,6

0,005

3

52,45

797

0.01

4

53,6

811

0.01

5

133,3

2010

0.025

6

134,5

2008

0,025

7

289,8

4307

0.05

8

285,1

4395

0.05

9

620,7

8596

0,1

10

623,1

8472

0,1

Пример анализа с градиентом режима раствора экстракта пшеничной муки с добавкой [81)

Рис. 11.16. Пример анализа с градиентом режима раствора экстракта пшеничной муки с добавкой [81)

Результаты расчета

Метод расчета:

Абсолютная концентрация

No

Площадь, mV • сек

Конц.,

нг/мкл

Название

1

347,53

0,00542

БаП

Значения 100 (WDW — D)/D составляют 10 и 16% для образцов 1 и 2 соответственно. Определяемое соединение в исходном образце пшеничной муки присутствует в количестве 0,00009 кг/кг.

Расчет содержания:

Образец 1 — 0,00064 мг/кг Образец 2 — 0,00067 мг/кг

  • [1] В общем случае градуировочная характеристика имеет виды S = АС + В, где S — площадь пика, у.е.; С — массовая концентрация загрязнителя, мкг/см3; А и В — коэффициенты.
 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >