Определение остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом ВЭЖХ

Методические указания МУК 4.1.1390-03

Вводная часть

Фирма-производитель: BayerCorp Science.

Торговое название: Конфидор, Гаучо, Адмир.

Действующее вещество: имидаклоприд (NTN 33893).

1 - (6-хлор-З-пиридил метил-N-нитроимидазол идин-2-илиденамин (ИЮПАК)
1-1(6-хлор-3-пиридин)метил-М-нитро-2-имидазолидинимин (С.А.). Структуная формула:

Эмпирическая формула: C9H10CIN5O2 Молекулярная масса: 255,7 Бесцветное кристаллическое вещество со слабым характерным запахом. Температура плавления: 144 °С.

Давление паров при 20 °С: 4 • 10^-7 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: TiWlog Р= 0,57. Растворимость (г/л) при 20 °С: вода 0,61; гексан менее 0,1; дихлор- метан 55; изопропанол 1,2; толуол 0,6.

Вещество устойчиво к гидролизу при pH 5—11 (77/2 более 1 года). Имидаклоприд относительно слабо передвигается по почвенному профилю и очень быстро разрушается в почве под действием света и микрофлоры. В растениях соединение постепенно метаболизируется.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс 450 мг/кг; острая дермальная токсичность (LDs0) для крыс более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LQo) для крыс 69 мг/м³ воздуха.

Имидаклоприд не вызывает раздражения слизистых оболочек кожи у кроликов.

LC50 для рыб 211 мг/л (96 ч).

Имидаклоприд практически нетоксичен для птиц, дождевых червей, водорослей, но опасен для пчел при прямом контакте.

Гигиенические нормативы: ОДК в почве — 0,1 мг/кг; ГТДК в воде водоемов — 0,03 мг/дм³; МДУ в картофеле — 0,05, огурцах и томатах — 0,1 мг/кг.

Область применения препарата. Имидаклоприд — инсектицид нервно- паралитического действия, эффективно уничтожает листовую тлю, бело- крылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Вещество обладает системной активностью и может использоваться для обработки почвы и надземных органов растений.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ в виде препарата «Гаучо 600 FS» (600 г имидаклоприда в 1 л препарата), предназначенного для протравливания семян и посадочного материала ряда культур, и препарата «Конфидор, ВРК» (200 г имидаклоприда в 1 л препарата), рекомендованного для обработки вегетирующих растений.

Методика определения остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Принцип метода

Метод основан на определении имидаклоприда методом обращенно-фа- зовой ВЭЖХ с УФД после извлечения препарата из воды дихлорметаном, из почвы и растительного материала — водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной градуировки.

Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании сахарной свеклы, картофеля, а также огурцов, томатов, перца и баклажанов открытого и защищенного грунта.

Метрологическая характеристика метода (табл. 111.29)

Таблица III.29. Метрологическая характеристика метода

	Метрологические параметры Р= 0,95, п = 20
Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/дм³, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/дм³, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S,%	Относительное стандарт, отклонение DS, %	Доверительный интервал среднего, %
Вода	0,0004	0,0004-0,004	84,9	3,7	1,7	±3,5
Почва	0,02	0,02-0,2	75,6	3,8	1,7	±3,5

Табл. 111.29 (окончание)

	Метрологические параметры Р= 0,95, п = 20
Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/дм³, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/дм³, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S,%	Относительное стандарт, отклонение DS, %	Доверительный интервал среднего, %
Огурцы	0,02	0,02-0.2	86,0	6,7	3,0	±6.3
Томаты	0,02	0,02-0.2	82,1	4,8	2,2	±4,5
Свекла сахарная	0,02	0,02-0,2	81,5	3,8	1,7	±3,5
Картофель	0,02	0,02-0.2	88,3	5,4	2.4	±5,0
Перец	0,02	0,02-0,2	81,9	3,7	1,6	±3,7
Баклажаны	0,02	0,02-0.2	83,2	4,0	1,8	±4,0

Реактивы, растворы, материалы

Имидаклоприд с содержанием д. в. 99,6% («Байер», Германия)
Ацетон	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил, ч.	ТУ 6-09-3534-82
Вода бидистиллированная	ГОСТ 7602-72
Гексан, ч.	ТУ 6-09-3375-78
Калия перманганат	ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, х. ч.	ГОСТ 4161-77
Калия карбонат, х. ч.	ГОСТ 4221-76
Кислота серная, х. ч.	ГОСТ 4204-77
Натрия карбонат	ГОСТ 83-79
Натрия гидроксид, х. ч.	ГОСТ 4328-77
Натрия сульфат безводный, х. ч.	ГОСТ 4166-76
Фосфора пентоксид, ч.	М РТУ 6-09-5759-69
Этилацетат	ГОСТ 22300-76
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан/этилацетат (4 : 6, по объему) Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан/этилацетат (2 : 8, по объему) Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил/вода (25 : 75, по объему) Силикагель для адсорбционной хроматографии («Вельм», Германия) 1 степени активности или силикагель КСК (60-100 меш) Стекловата Целит 535 (2—15 мкм) («Серва», Германия) или аналогичный Фильтры бумажные «синяя лента»	ТУ 6-09-1678-77

Приборы и оборудование

Жидкостный хроматограф с УФД (фирмы Altex, США) или аналогичный
Хроматографическая колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная диасорбом 130-С10С, МилиДиасорбом 130-С16Т (ЗАО «БиоХимМак»)
Шприц для ввода образцов в жидкостный хроматограф
Весы аналитические типа ВЛ Р-200	ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос	ГОСТ 10696-75
Встряхиватель механический	ТУ 64-1-10S1- 73
Гомогенизатор	М РТУ 42-1505-63
Ротационный испаритель типа ИР-1М	ТУ 25-11-917-76
Сито с диаметром отверстий 1 мм
Баня водяная	ТУ 46-22-603-75
Воронка Бюхнера	ГОСТ 0147-73
Воронки делительные, вместимостью 100, 250 мл	ГОСТ 25336-82
Воронки для фильтрования стеклянные	ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена	ГОСТ 5614-75
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100 и 250 мл	ГОСТ 9737-70
Колбы конические с притертыми пробками, вместимостью 250 мл	ГОСТ 25336-82
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл	ГОСТ 1770-74
Колбы грушевидные, вместимостью 100 и 250 мл	ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные, вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл	ГОСТ 20292-74Е
Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
Цилиндры мерные, вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74

Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051 -79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы, сахарной свеклы, огурцов, картофеля, томатов, перца и баклажанов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы растительного материала хранят до анализа в морозильной камере при температуре —18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 3 дней, при температуре —18 °С в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а растительный материал измельчают.

Подготовка к определению

Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и карбонатом калия (на 1 л ацетона 10 г КМп0₄ и 2 г К₂С0₃).

Ацетонитрил сушат над пентаоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над карбонатом калия.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора карбоната натрия, сушат над хлоридом кальция и перегоняют.

Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Отмеряют 250 мл ацетонитрила, переносят в колбу на 1000 мл, добавляют 750 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют, дегазируют.

Кондиционирование колонки

Промывают колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил/вода (25:75, по объему) в течение 30 мин при скорости подачи растворителя 0,6 мл/мин. Включают детектор и ждут стабилизации базовой линии (5—15 мин).

Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор имидаклоприда с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,6% д. в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре —12 °С не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,04, 0,08, 0,20 и 0,40 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора имидаклоприда соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более одного дня.

При изучении полноты определения имидаклоприда в модельных матрицах используются ацетонитрильные растворы вещества.

Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 0,04, 0,08, 0,20 и 0,40 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят градуировочный график зависимости высоты хроматографического пика (мм) от концентрации имидаклоприда в растворе (мкг/мл).

Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан/этилацетат (4:6, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан/этилацетат (2:8, по объему) и 30 мл смеси гексан/этилацетат (4:6, по объему) со скоростью 1—2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента № 1 и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента № 1 (гексан/этилацетат, 4:6), затем 60 мл элюента №2 (гексан/этилацетат, 2:8) со скоростью 1—2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и анализируют на содержание имидаклоприда.

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания имидаклоприда может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

Описание определения Экстракция имидаклоприда

Вода. 100 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и обрабатывают 10 мл гексана при встряхивании в течение 1 мин. Гексановый слой отбрасывают и водную фазу экстрагируют дихлорметаном трижды (30 + 30 + 20 мл). Объединенную органическую фазу промывают в делительной воронке 20 мл 0,05 М раствора К2СО3, а затем пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и анализируют.

Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон/вода (3:1, по объему) и суспензию перемешивают в течение 1 ч на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок переносят в колбу, приливают 50 мл указанной выше смеси, перемешивают 30 мин на аппарате для встряхивания и фильтруют суспензию через бумажный фильтр. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 35 мл), эквивалентную 5 г почвы. Дальнейшую очистку проводят по методикам, описанным ниже.

Сахарная свекла, картофель, огурцы, томаты, перец, баклажаны. К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 125 мл смеси ацетон/вода (3:1, по объему) и гомогенизируют 3 мин при 10000 об./мин. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу на 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл указанной выше смеси. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту' раствора (около 35 мл), эквивалентную 5 г растительной ткани. Дальнейшую очистку проводят по методикам, приведенным ниже.

Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного и почвенного экстрактов упаривают до объема 5—7 мл на роторном испарителе при температуре 30 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливают 40 мл бидистиллированной воды, 10 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 мин. Органический слой отбрасывают. Обработку водной фазы гексаном повторяют еще раз. Затем водную фазу трижды обрабатывают дих- лорметаном (30 + 30 + 20 мл) при встряхивании. Объединенный дихлорме- тановый экстракт промывают в делительной воронке 20 мл 0,05 М раствора К2СО3, а затем пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных экстрактов почвы или растительного материала, количественно переносят тремя порциями (1 мл) смеси гексан/этилацетат (4:6, по объему) в подготовленную хроматографическую колонку. Колонку промывают 30 мл смеси гексан/этилацетат (4:6, по объему), которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 50 мл смеси гексан/этилацетат (2:8, по объему) и собирают элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и анализируют на содержание имидаклоприда в условиях, приведенных ниже.

Примечание. При использовании новой партии сорбента или растворителей проводится проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке с силикагелем.

Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с УФД фирмы Altex.

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасорб 130-C10CN, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил/вода (25:75, по объему).

Скорость потока элюента: 0,6 мл/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. адсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Время выхода имидаклоприда: 6 мин 45 с.

Линейный диапазон детектирования: 2—20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,4 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С16Т (5 мкм). Подвижная фаза: метанол/вода (50:50, по объему).

Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин.

Время выхода имидаклоприда: 5 мин 20 с.

Обработка результатов анализа

Содержание имидаклоприда рассчитывают методом абсолютной градуировки по формуле

где X — содержание имидаклоприда в пробе, мг/кг или мг/дм³; Н — высота пика образца, мм; Я₀ — высота пика стандарта, мм; А — концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/мл; V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл; т — масса или объем анализируемой части образца, г или мл (для воды — 100 мл; для почвы и растительного материала — 5 г).

Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

Разработчики

Макеев А. М., к. б. н.; ДубоваяЛ. В. ВНИИ фитопатологии, Московская обл.