Функциональные и дисфункциональные зонды и рецепторы для исследования индукции экспрессии узелкового гена

Принципы, рассмотренные в разд. 7.8.1-7.8.3, могут быть применимы для активных сайтов ферментов и других биологических рецепторных структур. В любом случае, важным критерием в выборе биологической задачи для исследования методом биозондов с ИК-откликом является доступность хорошего теста на правильное связывание с рецептором. В случае ферментов подобные анализы, как правило, являются достаточно прямыми, поскольку возможность измерять степень превращения субстрата в продукт позволяет определить как /скат, так и kit и предоставляют средства для отличения функциональных и дисфункциональных зондов и рецепторов. В случае других биологических рецепторных структур необходимы либо прямое измерение биологических следствий процесса связывания, либо косвенный анализ. Кроме того, требуется также большая тщательность в развитии метода и выборе самой биологической системы.

Проект в Норвиче, направленный на исследование молекулярных событий, которые приводят к индукции гена и появлению корневых узелков в растениях семейства бобовых, и, таким образом, к аккумуляции бактерий, фиксирующих азот в узелках, был выбран с целью разработки методов, описанных в данной главе. Ключевым моментом здесь было сотрудничество с генетиками, и эти исследования оказались возможными благодаря тесным связям между Университетом Восточной Англии и Институтом Джона Иннеса в Норвич- ском исследовательском центре. Это сотрудничество позволило как проводить анализы на индукцию гена [107], так и разрабатывать подходы к функциональным и дисфункциональным биологическим образцам. Описание того, как были спланированы эти эксперименты, будет приведено в конце данной главы. Мы хорошо понимали, что только в том случае, если все факторы, влияющие на эксперимент, подобраны удачно, можно было надеяться расшифровать информацию, полученную при использовании подхода биозондов, дающих ИК-отклик, и прийти к ясному пониманию тех стадий молекулярного распознавания, которые и образуют основу биологических процессов. Можно полагать, что, несмотря на сложность исследуемых систем, существует возможность выделить специфический спектроскопический отклик и доказать правомерность его отнесения к той биологической проблеме, на решение которой направлен данный метод в том случае, если есть все необходимые инструменты с точными по своей природе сравнениями. Эти сравнения могут быть сделаны, благодаря мощи методов, основанных на АГК, позволяющих различить сходные спектроскопические эффекты (см. разд. 7.5.1 и 7.5.3), а также перспективности разных металлокарбонильных методов со спектроскопически комплементарными зондовыми группами (см. разд. 7.5.2).

Некоторые ключевые моменты ранних стадий химической биологии образования корневых узелков бобовых показаны на рис. 7.21. Корни бобовых растений подают сигнал молекулами флавоноидов [108], в ответ на который почвенная бактерия Rhizobium [107, 109-111] приближается к корням и проникает в них, образуя узелки [106]. В этом процессе задействована специфическая часть генома Rhizobium, и основным является один из генов (nodD) [109] (т. е. происходит постоянная транскрипция этого гена, и белок, кодируемый им, всегда доступен). В присутствии флавоноидов происходит транскрипция всех генов [112-114], и эта индукция экспрессии нодального (узелкового) гена требует присутствия гена nodD (nodD(-)-urraMMbi не реагируют на флавоноиды). Поэтому предположили, что белок, кодируемый nodD, является регуляторным белком, который связывает флавоноиды и затем «включает» работу остальных нодальных генов. Было также известно, что для проявления биологической активности необходимо наличие групп ОН в обоих ароматических кольцах флавоноидов [115] (типичные примеры - высокоок- сигенированные флавоноиды, такие как нарингинин 47 и эриодиктиол 48 Поэтому были получены и тестированы производные оксигенированных флавоноидов, содержащие металлокарбонильные группы.

Действительно, в исследованиях такого рода легко определяются «дисфункциональные зонды» [76, 78], поскольку наиболее вероятным результатом при добавлении комплекса циклогексадиенилжелеза должно быть отсутствие специфических взаимодействий между флавоноидом и предполагаемым рецептором (примером служит соединение 22 на рис. 7.13). Однако следует подчеркнуть, что даже такие отрицательные результаты важны и способствуют развитию проекта, поскольку для окончательных выводов необходимо выбрать хорошие примеры дисфункциональных зондов, чтобы иметь набор для спектроскопических сравнений. Главная задача заключается все же в поиске активных металлоорганических производных, а для выявления отличий активных соединений от неактивных требуется хороший скрининг. В данном случае в участок генной последовательности Rhizobium nodA-nodB-nodC был встроен дополнительный ген рядом с nodD. Этот дополнительный ген (lacZ), который кодирует р-галактозидазу, был взят из Е. СОН, а не из Rhizobium. Когда происходит индукция гена, дополнительный ген также транскрибируется, и мутантный Rhizobium производит Р-галактозидазу [107]. Это легко определяется колориметрическим анализом [116] по гидролизу я-нитрофенолгалактозида. В этом случае весьма важна генетическая экспертиза для того, чтобы был возможен соответствующий скрининг. Без такой возможности проблема индукции гена Rhizobium не могла бы стать задачей для решения с помощью биозондов с ИК-откликом. Комплекс 23 (рис. 7.13) служит примером флавоноидного производного, которое сохраняет способность к индукции экспрессии нодального гена.

Иллюстрация роли сигнальных молекул флавоноидов (например, 47 и 48) в образовании корневых узелков в бобовых растениях

Рис. 7.21. Иллюстрация роли сигнальных молекул флавоноидов (например, 47 и 48) в образовании корневых узелков в бобовых растениях

Заключительная роль генетиков в данном проекте состояла в том, чтобы провести функциональное/дисфункциональное сравнение [78] в биологическом образце. Простой подход к дисфункциональному случаю очевиден, поскольку ему соответствует nodD(-)-мутант, о котором было сказано выше. В качестве функционального случая можно было использовать дикий тип, но гораздо лучший подход основан на изогенном штамме, в котором наблюдается суперэкспрессия гена nodD. При культурировании такой штамм будет создавать значительно более высокие концентрации D-белка, чем дикий тип, увеличивая тем самым вероятность спектроскопического детектирования взаимодействия D-белок-флавоноид. Были использованы nodD(-)-urraMM Rhizo- bium leguminosarum WT(8400pRLl) и тот же мутант, несущий множественные копии гена nodD на плазмиде plj 1518. Поскольку эти два штамма идентичны, за исключением продуцирования белка D, любое различие в ИК-спектрах должно быть вызвано именно белком D.

Эксперимент спланирован таким образом, что он имеет три степени контроля и позволяет интерпретировать различия между функциональным и дисфункциональным зондами (на рис. 7.22 сравните случаи в и ж) как следствие связывания функционального зонда с рецептором. Если такие различия не детектируются, тогда используется дисфункциональный биологический образец (рис. 7.22: белок D отсутствует).

Аналогично, можно различить функциональный и дисфункциональный рецепторы (рис. 7.22: сравните в и л), поскольку один и тот же эффект не будет наблюдаться как в случае ж, так и в случае и. Это не является критерием того, что ж, л и м относятся к одному и тому же случаю, а в - к какому-то уникально отличному. Вопрос является более тонким, и для успеха эксперимента необходимо, чтобы любое наблюдаемое различие исчезало при использовании дисфункционального компонента вместо функционального. Это должно иметь место для каждой комбинации, в которой используются дисфункциональные компоненты.

На данный момент полный набор сравнений, доступных для структур с «локальным откликом», таких как 23 (рис. 7.13) и для соответствующих аналогов с «отдаленным откликом» ждет дальнейшей работы по синтезу. В качестве конечного эксперимента [78] с соединениями, доступными сейчас, мы проверили применимость требуемых спектроскопических измерений на соединении 23 при концентрациях столь низких, как 50 мкМ. Даже при столь низком уровне концентраций в присутствии осколков лизированных клеток Rhizobium leguminosarum WT(8400pRLl).pIJ 1518 были обнаружены вполне различимые валентные колебательные моды vchmmC0 и vaimicl)MMCO при 2045 и 1965 см'1. Существующие сейчас синтетический [76, 78], спектроскопический [78], генетический [78, 107] и концептуальный (настоящая глава) методы, все же диктуют необходимость синтеза более прочно связывающихся металлоорганических производных и аналогов отдаленного отклика (см. разд. 7.8.1) со структурами, обладающими более высокой активностью. Эта проблема сходна с задачами, с которыми столкнулась группа Жауэна в их успешной пионерской работе, направленной на изучение рецепторов эстрогенов (см. разд. 7.6 и гл. 3).

Сравнение функциональных и дисфункциональных систем [сравните в и ж с рис

Рис. 7.22. Сравнение функциональных и дисфункциональных систем [сравните в и ж с рис. 7.20; л и м - новые примеры случая к], позволяющее провести спектроскопическую идентификацию специфических эффектов, вызванных взаимодействием металлокарбонильного биозонда с биологическим рецептором

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >