Микробная контаминация в технологии этилового спирта

Микроорганизмы-контаминанты бродильных производств

К основным мнкроорганизмам-контаминантам спиртового производства относятся: молочнокислые, уксуснокислые, маслянокислые и гнилостные бактерии, а также дикие дрожжи [1, 96]. Как правило, уровень микробной контаминации колеблется в пределах 10—109 КОЕ/мл [96].

Причинами контаминации зачастую становятся несоблюдение технологических режимов и графиков санитарно-профилактического обслуживания оборудования. В зависимости от используемой схемы технологического процесса и оборудования существуют многочисленные возможности для сохранения микроорганизмов-контаминантов и их активной жизнедеятельности [96]. Например, в ходе комплексного микробиологического исследования работы спиртового завода было установлено, что контаминация замочной воды, используемой для приготовления замеса, после пастеризации увеличилась на порядок (с 105 КОЕ/мл до 106 КОЕ/мл), что, вероятно, связано с повторной контаминацией ее через теплообменники [96].

Наибольшую опасность для производства представляют бактерии. Они могут развиваться за счет сахара и за счет спирта. Основным источником проникновения микроорганизмов-контаминантов на производство является зерновое сырье, особенно дефектное. Анализ микробиологического состояния различных культур показал, что общее количество микроорганизмов в дефектном зерне в 4-5 раз выше по сравнению с кондиционным, что приводило к ускоренному закисанию осахаренного сусла [5].

На спиртовых заводах часто используют воду из открытых водоемов и прудов, в которых находится значительное количество различных микроорганизмов: Escherichia coli, Escherichia freundi, Klebsiella aerogenes,

Actobacter cloacae, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Pseudomonas nonliguefaciens. В 1 мл прудовой воды может находиться несколько сот кислотообразующих бактерий [1].

В воздухе часто встречаются Bacillus mesentericus. Bacillus megatherium, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, бактерии родов Pseudomonas, Sarcina (Sarcina lutea), споры плесневых грибов родов Penicillium и Aspergillus, дрожжеподобные грибы рода Candida и редко - молочнокислые бактерии [1].

Попадая в дрожжевые и бродильные аппараты, эти микрорганизмы могут накапливаться в значительных количествах и даже вытеснять производственную культуру дрожжей. Контаминирующие микроорганизмы потребляют из сусла часть питательных веществ, снижая выход спирта. Кроме того, они образуют органические кислоты и другие метаболиты, инактивирующие ферменты осахаривающих материалов, снижающие бродильную активность дрожжей, в результате чего в зрелой бражке повышается количество несброженных сахаров и крахмала [ 1 ] и ухудшается качество этилового спирта [5].

Микроорганизмы-контаминанты могут образовывать на поверхности оборудования трудно удаляемые биопленки, придающие им устойчивость к действию неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности к антибиоткам [120]. Способность образовывать биопленки была обнаружена у молочнокислых бактерий Lactobacillus amylovorus, L. fermentum, и L. vaginalis - типичных контаминатов спиртового производства [120].

Причиной микробной контаминации технологического процесса может служить неправильная подготовка сырья, так при несоблюдении режимов огневой сушки влажного сырья на поверхности зерновки могут происходить значительные повреждения, на месте которых начинается интенсивное развитие микроорганизмов, а следовательно, ускоряются неблагоприятное биохимические и микробиологические процессы, что приводит к ухудшению качества зерна. Кроме того, при длительном нагреве сырья при высокой температуре происходит снижение содержания белковых веществ и, как следствие, резкое ухудшение технологических свойств зерновых культур при дроблении. Денатурированные белки в таком зерне при дальнейшей переработке на спирт оседают на технологическом оборудовании и трубопроводах, становясь новыми очагами развития микроорганизмов-контаминантов [5].

Молочнокислые бактерии (МКБ) - это грамположительные, неспорообразующие (за исключением Sporolactobacillus) палочки или кокки, факультативные анаэробы и микроаэрофилы. Метаболизм МКБ бродильного типа с образованием в качестве конечного продукта молочной кислоты (гомоферментативные бактерии) либо смеси молочной кислоты с СО?, уксусной кислотой и/или этиловым спиртом (гетероферментативные бактерии) [37, 121]. Некоторые МКБ обладают способностью гидролизовать крахмал, например Lactobacillus amylolyticus, выделенные из пивного сусла, и Lb. manihotivorans, выделенные из продуктов брожения крахмала маниоки [37]. Многие МКБ устойчивы к температуре, минеральным кислотам и этиловому спирту.

Группа МКБ включает несколько родов: р. Lactobacillus (типовой представитель Lb. delbrueckii) - клетки палочковидной формы, но иногда почти кокковидные, встречаются как гомоферментативные, так и гетероферментативные представители; гомоферментативные кокки р. Enterococcus (типовой представитель Е. faecalis, прежнее название Streptococcus faecalis), р. Lactococcus (типовой представитель L. lactis), р. Pediococcus (основной представитель Р. damnosus)', гетероферментативные кокки р. Leuconostoc (типовой представитель Leuc. mesenteroides) [37, 122]. Согласно последним данным род Leuconostoc составляют три филогенетически разных рода: Leuconostoc sensu stricto, Oenococcus oenos (прежнее название Leuconostoc oenos) и Weissella, в который входят Leuconostoc paramesenteroides и некоторые гетероферментативные лактобациллы (например, Lb. confusus и Lb. kandleri, называемые теперь IV. confusa и W. kandleri) [37].

МКБ являются частыми контаминантами производственных процессов, связанных со спиртовым брожением, до 44-87 % от общего количества выделенных бактерий [96, 117, 123].

С жизнедеятельностью МКБ связаны такие «заболевания» вин, как: скисание вина (накопление молочной и других летучих кислот), «ожирение», или «болезнь тягучих вин», разложение глицерина - прогоркание, разложение винной кислоты [124]. «Заболевания» вин вызывают гетероферментативные (Lb. fermentum, Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. cellobiosus, Lb. viridescens, Lb. fructivorans, Lb. hilgardii, Lb. desidiosus) и гомоферментативные (Lb. plantarum, Lb. casei) лактобациллы, а также гомоферментативные (Pediococcus cerevisiae, P. pentosaceus) и гетероферментативные (Leuconostoc oenos) кокки [125].

Примерно 60-70 % микробиологических инцидентов в пивоваренном производстве связано с МКБ [126]. МКБ развиваются на солоде, в сусле и в готовом пиве [37, 127]. Многие МКБ, обнаруживаемые в полупродуктах и пиве, устойчивы к антимикробному действию горьких кислот хмеля, к ним относятся штаммы Lactobacillus brevis, Lb. lindneri, Lb. paracollinoides, и Pediococcus damnosus [126]. Неустойчивые к хмелю МКБ могут развиваться в неохмеленном сусле [127]. Возбудителями порчи полупродуктов пивоваренного производства (затор, неохмеленное и охмеленное сусло) являются бактерии р. Pediococcus (Ped. pentosaceus, Ped. inopinatus) [127], а готового пива - p. Lactobacillus (Lb. brevis, Lb. brevisimilis. Lb. casei, Lb. collinoides. Lb. coryneformis, Lb. curvatus, Lb. lindneri, Lb. plantarum [127], Lb. paracollinoides [126]) и p. Pediococcus (Ped. damnosus. Ped. inopinatus') [37, 121, 127, 128]. Последствия развития МКБ в полупродуктах и пиве - ухудшение вкусовых и ароматических показателей готового продукта, помутнение [37, 121, 127]. МКБ могут играть и положительную роль в пивоварении: предлагается использовать их на стадии солодоращения для подавления развития плесневых грибов [127, 129]. Данное применение основано на способности многих МКБ синтезировать антимикробные вещества, некоторые из которых имеют белковую структуру и являются антибиотиками (низин и др.), другие представляют собой низкомолекулярные соединения (органические кислоты, диацетил и др.) [127, 129]. МКБ также могут быть добавлены в неохмеленное сусло для подкисления, при этом pH среды снижается до значения 4,5 и ниже и создаются условия, неблагоприятные для развития других микроорганизмов, способных ухудшить качество пива, а также ускоряются ферментативные процессы и улучшается вкус пива [129]. Для биологического подкисления используют штаммы Lactobacillus delbrueckii, Lb. amylovorus и Pediococcus acidilacti [127, 129].

Контаминация МКБ представляет серьезную проблему при производстве саке. Данная группа МКБ, называемая в Японии Hiochi bacteria, способна расти при концентрации этилового спирта 15 % об. и более. В нее входят отдельные штаммы видов Lactobacillus heterohiochii, Lb. homohiochii, Lb. plantarum, Lb. japonicus, Lb. casei subsp. rhamnosus, Lb. casei subsp. casei [130].

При производстве шотландского виски МКБ попадают в сусло вместе с экстрактом соложеного ячменя. Экстракт готовят, обрабатывая размолотый солод горячей водой с температурой около 63 °C в течение 30 мин. Если количество МКБ превышает == 106 КОЕ/мл, они вступают в конкуренцию с дрожжами за питательные вещества и снижают выход спирта, но при правильном управлении всеми процессами МКБ начинают развиваться только после того, как дрожжевые клетки перешли в стационарную фазу. Такой процесс, называемый «позднее молочнокислое брожение», даже поощряется многими производителями виски, так как улучшает вкусовые качества продукта [131]. В ферментационной среде при производстве виски обнаруживаются следующие виды МКБ: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus brevis. Lb. fermentum. Lb. casei, Lb. ferintoshensis, Lb. acidophilus. Lb. delbruekii [131], Weissella confusa, W. kimchii [132].

В спиртовом производстве обнаруживаются следующие МКБ: Lactobacillus plantarum [133], Lb. paracasei, [134] Lb. fermentum [135, 136], Lb. casei [137], Lb. brevis [138], Lb. delbrueckii, Lb. collinoides, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. crispatus [96, 139, 140], Leuconostoc mesenteroides, Leuc. agglutinans, Lactococcus sp., Pediococcus sp„ Weissella sp. [1]. Бактерии Leuc. mesenteroides образуют слизистую капсулу, которая придает им устойчивость к температуре и кислотам. В жидких средах они погибают при 112-120 °C в течение 20 мин, а в 0,5 % растворе H2SO4 сохраняют жизнеспособность в течение часа [1]. Потери от развития МКБ в спиртовом производстве могут составить до 22 % конечного продукта

[140] . МКБ образуют большое количество органических кислот, которые оказывают негативное воздействие на жизнедеятельность дрожжей: замедляют рост, снижают жизнеспособность клеток, вызывают флокуляцию дрожжей

[141] , уменьшая тем самым выход спирта [135, 137, 140]. Некоторые МКБ усиливают образование глицерина дрожжами [140]. Молочная кислота в концентрации 4,8 г/л значительно замедляет почкование дрожжей, а свыше 6 г/л снижает выход этилового спирта [135]. Бактерии рода Leuconostoc (например, Leuc. agglutinans) продуцируют слизистый полисахарид декстран, который обволакивает клетки дрожжей, препятствуя тем самым поступлению питательных веществ, а также склеивает клетки друг с другом, вызывая их агглютинацию [1, 142].

Для эффективного предотвращения развития МКБ в бродильных производствах требуются высокие начальные концентрации дрожжей в сусле - 3-107—4-107 КОЕ/мл [134].

В экспериментах [139] с искусственной контаминацией сусла бактерии Lactobacillus plantarum, Lb. fermentum, Lb. rhamnosus при концентрации ~ 106 КОЕ/мл снижали финальную концентрацию спирта примерно на 2 % по сравнению с контролем, Lb. paracasei вызывали подобный эффект уже при концентрации 105 КОЕ/мл. Авторы объясняют этот эффект большей толерантностью к спирту, более короткой стадией адаптации и/или интенсивным метаболизмом данной бактерии. При сильной контаминации сусла ~ 109 КОЕ/мл снижение выхода спирта составило от 3,8 до 7,6 % в зависимости от штамма [139].

В то же время D. Bayrock и W.M. Ingledew показали, что в условиях непрерывного сбраживания высокоплотного сусла бактерии Lb. paracasei не способны оказывать существенного влияния на жизнеспособность дрожжей и количество образуемого ими этилового спирта даже при 70-кратном численном превосходстве [117].

Маслянокислые бактерии - грамположительные спорообразующие палочки, облигатные анаэробы. Споры маслянокислых бактерий устойчивы к нагреванию. Продуцируемая ими масляная кислота в очень малых концентрациях (0,0005 %) подавляет развитие дрожжей [1]. При концентрации кислоты 0,024 % размножение дрожжей составляет только около 3 % от первоначального. Под влиянием этой кислоты дрожжи сильно ослабевают, в результате чего в бражке остается много несбродившего сахара. Наряду с масляной кислотой маслянокислые бактерии могут образовывать уксусную, молочную, капроновую, каприловую и другие кислоты, а также этиловый и бутиловый спирты и ацетон. Наиболее распространены следующие виды маслянокислых бактерий: Clostridium butyricum, С. pasterianum, С. saccharobutyricum [1], С. aerotolerans, С. clostridiiforme [96]. Оптимальная температура для роста бактерий - 30-40 °C, при pH ниже 4,9 они не развиваются [1]. Как анаэробы эти бактерии обнаруживаются в самых недоступных местах: в трубопроводах, насосах, запорной арматуре и т.д.

Уксуснокислые бактерии - грамотрицательные палочковидные бесспоровые, строго аэробные организмы, развивающиеся в тех же условиях, что и дрожжи. Они вызывают порчу вина, пива, сидра и т.д. [37, 121]. Данные бактерии способны окислять этиловый спирт в уксусную кислоту, пропиловый спирт - в пропионовую кислоту, бутиловый спирт - в масляную кислоту. При накоплении в сбраживаемом сусле 0,01 % уксусной кислоты задерживается, а при 0,2 % подавляется жизнедеятельность дрожжей. Некоторые виды этих бактерий способны окислять также глюкозу в глюконовую кислоту, ксилозу и арабинозу - в ксилановую и арабановую кислоты. Этиловый спирт - главный источник жизнедеятельности уксуснокислых бактерий [1].

Наиболее распространенные виды уксуснокислых бактерий: Acetobacter aceti, Acet, pasteurianum. Acet, oxydans. Они имеют форму палочек длиной 1-3 мкм, часто соединены в цепочки. Оптимальная температура для роста - 20-35 °C [1]. При концентрации спирта выше 6 % размножение большинства уксуснокислых бактерий прекращается, но некоторые штаммы {Acetobacter sp. BS05, Ghiconobacter oxydans NC1B 9013) способны расти при 10 % и даже 12-13 % концентрации спирта [37].

Бациллы - грамположительные спорообразующие палочки, аэробы или факультативные анаэробы [122]. Они подвижны, образуют споры, отличающиеся высокой термоустойчивостыо, температурный оптимум для их развития - 36-50 °C [1]. Наиболее часто встречаются Bacillus subtilis, В. mesentericus. В. subtilis, В. mesentericus, В. megatherium являются нитритообразующими бактериями (редуцирующими нитраты в нитриты). Нитриты в концентрации 0,0005 % задерживают размножение дрожжей [1]. Сообщается, что некоторые виды Bacillus вызывают порчу неохмеленного пивного сусла [37].

Бактерии семейства Enterobacteriaceae грамотрицательные палочки, факультативные анаэробы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма, большинство представителей восстанавливают нитрат [143]. Данное семейство включает большое количество родов бактерий, многие из которых являются потенциальными контаминантами бродильных производств. Так, на пивоваренных предприятиях обнаруживаются следующие: Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Obesumbacterium, Proteus, Rahnella, Serratia, Erwinia [37, 121]. Наиболее часто в неохмеленном сусле развиваются Rahnella aquatilis, Citrobacter freundii, Klebsiella terrigena, K. oxytoca, Obesumbacterium proteus, в охмеленном - Rahnella aquatilis, Obesumbacterium proteus [127]. Энтеробактериальная контаминация сусла происходит чаще всего на начальном этапе брожения.

Энтеробактерии продуцируют различные метаболиты, ухудшающие вкус пива [37, 121].

Obesumbacterium proteus устойчива к спирту и способна расти при его концентрации до 6 % об. Бактерии данного вида размножаются вместе с дрожжами и тормозят процесс ферментации. О. proteus - контаминант засевных дрожжей [37].

Rahnella aquatilis хорошо развиваются в сусле независимо от присутствия дрожжей, аккумулируются в повторно используемых засевных дрожжах. R. aquatilis гибнут при концентрации спирта 11-12 % об. [37].

Citrobacter freundii понижает жизнеспособность дрожжей, чувствителен к высоким концентрациям спирта [37].

Дикие дрожжи представляют значительную опасность для спиртового брожения. Они потребляют большое количество сахара и образуют мало спирта, снижая тем самым его выход. Многие из них превращают сахар в органические кислоты и другие метаболиты и окисляют спирт [1, 144]. В настоящее время известно, по крайней мере, 24 вида диких дрожжей-контаминантов родов Candida, Torulaspora, Kluyveromyces, Pichia, Brettanomyces, Dekkera, Williopsis и др. [37, 121, 145— 147]. Из них наибольшую опасность представляют Dekkera bruxellensis, Pichia galeiformes и Candida tropicalis, обнаруженные в самых серьезных случаях контаминации (до 30 % от общего количества дрожжевой биомассы) на спиртовых заводах Бразилии, США и Канады [146]. Оперативное выявление контаминации сусла дикими дрожжами может быть осуществлено при помощи ПЦР-анализа [146, 148, 149].

Согласно другим данным дикие дрожжи, в частности Brettanomyces и Dekkera, не способны оказывать существенного влияния на процесс спиртового брожения [150, 151], так как скорость их роста в нормальных условиях сусла ниже скорости роста Saccharomyces cerevisiae, а инциденты с участием дрожжей родов Brettanomyces и Dekkera связываются со злоупотреблением некоторыми спиртовыми заводами практикой аэрирования [150]. В аэробных условиях дрожжи Brettanomyces bruxellensis ферментируют глюкозу в уксусную кислоту вместо этанола [150]. Для нормального спиртового брожения концентрация кислорода в сусле должна составлять примерно 8-20 мг/л, что соответствует скорости аэрации 0,00011-0,00028 мл воздуха на мл сусла в минуту, но предприятия обычно добавляют кислород в большом избытке, создавая тем самым благоприятные условия для размножения дрожжей родов Brettanomyces и Dekkera и синтеза ими уксусной кислоты [152].

Мицелиальные грибы не представляют непосредственной угрозы спиртовому брожению, так как оно протекает в анаэробных условиях. Хотя некоторые плесневые грибы способны расти в микроаэрофильных условиях [39], литературные данные об их жизнедеятельности в бродящем сусле отсутствуют. Тем не менее микотоксины - вторичные метаболиты плесневых грибов - подавляют жизнедеятельность дрожжей и способны замедлить процесс брожения [46-48].

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >