Результаты собственных исследований

Были изучены морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и патогенные свойства культур микобактерий, изолированных из организма животных и объектов внешней среды животниводческих ферм, благополучных и неблагополучных по туберкулезу.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования были 1133 пробы диагностического материала, в том числе 244 пробы (кусочки внутренних органов и лимфатических узлов) от крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин для млекопитающих, 769 проб от лабораторных животных и телят, экспериментально зараженных возбудителем туберкулеза бычьего вида и атипичными микобактериями, а также 120 проб молока и проб-смывов с молочного оборудования.

Лабораторные исследования проводили согласно «Методическим указаниям по диагностике туберкулеза животных» (1976), «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» (1986) и ГОСТ 26072-84 «Животные и птица сельскохозяйственные» (1984).

Дифференциацию и идентификацию микобактериальных культур проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (Ильина, 1975, 1980). У выделенных культур изучали:

  • - скорость роста субкультур на среде Левенштейна-Йенсена при температуре 22, 37, 45 и 52°С;
  • - характер роста на среде Левенштейна-Йенсена и мясопептонном бульоне при 37°С;
  • - характер микророста микобактерий по методу Прайса (1941) с использованием среды Сотона;
  • - характер колоний: величину, форму, поверхность, консистенцию и т.д.;
  • - тинкториальные свойства (окраска по Цилю-Нильсе-ну, Граму, Мурохаши);
  • - способность к пигментообразованию на свету и в темноте по методу Kubica (1973);
  • - рост на среде Левенштейна-Йенсена с содержанием в 1 мл среды 0,5 и 1,0 мг салицилата натрия по методу TsuKamura (1962);
  • - рост на среде Левенштейна-Йенсена с содержанием в 1 мл среды 2,0 мг парааминосалицилата натрия по методу Tsukamura (1962);
  • - толерантность к 5%-му хлориду натрия по методу Kestle et al. (1967);
  • - реакцию гидролиза твина-80 по методу Wayne (1962);
  • - ниациновый тест по методу Коппо (1957) в модификации Э.В. Сидоркиной, А.С. Бейсенбекова (1981);
  • - редукцию нитратов по методу TsuKamura et al. (1966);
  • - амидазную активность по методу Taguet et al. (1967) в модификации Т.Б. Ильиной (1978);
  • - формамидазную активность по методу Nagayama et al. (1961) в модификации М.М. Дыхно (1964);
  • - арилсульфатазную активность по методу Tarshis (1964), Wayne et al. (1967);
  • - каталазную активность по методу Wayne (1962);
  • - деградацию салицилата и парааминосалицилата натрия по методу TsuKamura (1966);
  • - лекарственную чувствительность к препаратам I ряда: стрептомицину, изониазиду, ПАСК определяли непрямым методом, выращивая культуры микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена (без крахмала), содержащей различные концентрации препаратов.

Для отличия микобактерий туберкулеза от кислотоустойчивых сапрофитов при бактериоскопическом исследовании применили методику Л.Е. Скрябиной (1955).

Для определения видовой принадлежности микобактерий туберкулеза и степени их патогенности заражали лабораторных животных по общепринятым методикам. Павших и убитых по истечении 3 мес после заражения животных вскрывали, учитывали наличие и характер туберкулезных изменений во внутренних органах и лимфатических узлах по методике А.И. Тогуновой. Посев патологического материала проводили на среды Левенштейна-Йенсена по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши.

При изучении культурально-морфологических, тин-кториальных, биохимических свойств и лекарственной чувствительности у эпизоотических культур микобактерий, а также культур, полученных в экспериментах, в качестве контроля использовали референтные культуры микобактерий, любезно предоставленные нам Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Тарасевича, Центральным научно-исследовательским институтом туберкулеза и Всесоюзным научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии (М. bovis шт. 8., М. avium шт. «Берлин», М. avium шт. 19, М. intracellularae, М. хепо-pi, М. gordonae, М. gastri, М. terrae, М. nonchromogenicum, М. fortuitum, М. diernhoferi, М. В-5, М. smegmatis, М. phlei, М. flavescens, М. vaccae).

Сравнительное изучение разных методов введения суспензий исследуемых культур лабораторным животным для дифференциации микобактерий проводили на 99 морских свинках, 27 кроликах и 30 куриных эмбрионах, используя методики, предложенные Honi (1925), Kite и Patnode (1952), Todao-Todda, Fodor-Ferenczi. Объектом исследования служили 27 штаммов музейных и производственных культур микобактерий.

В первом опыте при сравнительном изучении интра-тестикулярного и подкожного методов заражения использовали 36 морских свинок массой тела 300-350 г, которых разделили на 12 групп по 3 в каждой. Заражение проводили культурой М. bovis (шт. 8, 14, 92, 94).

Животных 1, 2, 3 и 4-й групп заразили подкожно во внутреннюю поверхность бедра в дозе 1 мг бактериальной массы в 1 мл физиологического раствора. Морских свинок 5, 6, 7 и 8-й групп заразили интратестикулярно в дозе 1 мг бактериальной массы в 0,4 мл физиологического раствора. Животные 11-й и 12-й групп были контрольными (интактными). Во всех опытах степень патогенности изучаемых культур оценивали по срокам гибели зараженных животных, по снижению массы тела и по интенсивности поражения внутренних органов. В первом опыте макроскопические изменения внутренних органов и лимфатических узлов оценивали по схеме А.И. Тогуновой, согласно которой максимальная пораженность равна 30-31. При индексе пораженности меньше 15 туберкулезный процесс рассматривали как маловыраженный, а культуру - как слабовирулентную; индекс пораженности, равный 15-18, соответствовал туберкулезу средней тяжести и средней вирулентности культуры, а индекс 24-31 - тяжелому развитию туберкулеза и высокой вирулентности культуры. Использование числовых показателей (индексов) при оценке патолого-анатомических изменений позволило применить математический метод для проверки достоверности результатов опытов.

Во втором опыте, поставленном для выявления патогенности атитипичных микобактерий, 45 морских свинок разделили на 9 групп по 5 в каждой. Животным 1, 2, 3 и 4-й групп микобактериальные суспензии (М. avium, М. smegmatis, М. fortuitum, М. phlei) вводили под кожу в дозе 1 мг бактериальной массы в 1 мл физиологического раствора; животным 5, 6, 7, 8-й групп вводили те же культуры и в той же последовательности в тестикулы в дозе 1 мг бактериальной массы в 0,4 мл физиологического раствора; животные 9-й группы были контрольными (интактными).

В этом опыте для оценки характера патолого-анатомических изменений у свинок использовали другой цифровой показатель - селезеночный индекс (СИ), так как индекс пораженности по Тогуновой применяют при наличии выраженных макроскопических изменений туберкулезного характера, которые, как правило, не развиваются у лабораторных животных, инфицированных атипичными микобактериями.

Объектами исследования служили культуры микобактерий, выделенные нами от крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин, и дифференцированные как М. avium, М. smegmatis, М. fortuitum и М. phlei. Исследуемые культуры по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам имели идентичные показатели с референтными штаммами этих же видов.

Клинические наблюдения за морскими свинками вели в течение 3 мес. При патолого-анатомическом вскрытии животных через 30 и 90 дней отбирали материал для бактериологического и гистологического исследований.

Для выяснения достоверности внутрикожного метода заражении при дифференциации микобактерий туберкулеза от атипичных мы провели три эксперимента на 18 морских свинках и 27 кроликах массой не менее 3000 г. В опытах на аналогичных по возрасту и массе тела здоровых животных было изучено 27 культур микобактерий, из них музейных: М. bovis шт. 8, М. avium шт. «Берлин», 19, М. gordonae, М. fortuitum, М. vaccae, М. phlei, М. smegmatis, М. diernhoferi; производственных: М. bovis шт. 14, 92, 94, 99, 100, М. avium шт. 163, М. gastri шт. 63, М. terrae шт. 66, М. gordonae шт.

125, M. fortuitum шт. 19, 70, 127, М. smegmatis шт. 129, 130, М. phlei шт. 126, М. fiavescens шт. 2, 81, М. diernhoferi шт. 64.

Культуру каждого из перечисленных штаммов вводили трем морским свинкам и трем кроликам в дозе 0,1 мг полу-влажной бактериальной массы, суспендированной в 0,1 мл физиологического раствора. Морским свинкам суспензии вводили в четыре изолированные точки живота, 18 кроликам - в область наружного края уха, так чтобы площадь для одной пробы была не менее 2 см, а 9 кроликам суспензии микобактерий инъецировали в кожу после ее депиляции на внутренней стороне локтевого и коленного суставов в той же дозе. Реакцию в месте введения культуры учитывали через 48, 72 ч и в последующем через каждые трое суток до гибели животных. При этом определяли средние размеры (диаметр) воспалительной реакции по группе, время появления некрозов и язв, наличие вторичных воспалительных изменений, начало и окончание заживления с эпителизаци-ей кожного дефекта.

В четвертом опыте в качестве экспериментальной модели для дифференциации атипичных микобактерий от возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота использовали 6-9-дневную хорион-аллантоисную оболочку развивающегося куриного эмбриона, при этом провели сравнительное изучение макроскопических и гистологических изменений хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов при заражении различными культурами микобактерий: М. bovis шт. 14, М. avium шт. «Берлин», М. phlei, М. gordonae, М. fortuitum, М. smegmatis. Каждой культурой заражали по пять эмбрионов. Заражение проводили суспензией, приготовленной из расчета 0,1 мг культуры в 0,2 мл физиологического раствора, которую наносили шприцем на поверхность через отверстие в скорлупе в области воздушного мешка. В качестве контроля пяти эмбрионам на поверхность ХАО наносили 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Все эмбрионы выдерживали в термостате в течение 8-10 сут при 38°С. После инкубации их вскрывали и изучали состояние

ХАО. Участок оболочки вырезали и фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, далее фиксированную оболочку заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Одновременно при взятии материала для гистологического исследования отбирали материал для бактериологического исследования.

Следующим этапом работы было изучение достоверности шести культурально-биохимических тестов, рекомендованных М. Tsukamura et al. (1962, 1966), D. Kestle et al. (1967) и А.А. Прозоровым (1956) для дифференциации микобактерий:

  • 1) определение чувствительности микобактерий к 0,05 и 0,1%-му салицилату натрия;
  • 2) определение чувствительности к 0,2%-му ПАСК;
  • 3) определение устойчивости микобактерий к 5%-му хлориду натрия;
  • 4) тест деградации салицилата натрия;
  • 5) тест деградации ПАСК;
  • 6) определение чувствительности микобактерий к кислотно-основным индикаторам (малахитовая зелень и ней-тральрот), добавляемым в питательные среды Петраньяни и Левенштейна-Иенсена. При изучении указанных тестов использовали 69 штаммов референтных и производственных культур микобактерий, суспензии которых высевали в 4968 пробирок со средами.

Приготовление сред с добавлением различных препаратов и методики проведения опыта изложены Т.Б. Ильиной в методических рекомендациях «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (1980) и А.А. Прозоровым (1956).

Приготовление взвесей микобактерий в экспериментах по изучению выживаемости и влиянию физических факторов на возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота и атипичные микобактерии, находящиеся в воде, физиологическом растворе и молоке, осуществляли из расчета 1,5 млн микробных тел в 1 мл исследуемого материала.

Объектами исследования служили 13 культур микобактерий, выращенных на среде Левенштейна-Иенсена, из них: 3-недельные культуры М. bovis (шт. 8,14,92), 2-недель-ные культуры М. avium (шт. 163, «Берлин»), М. intracellular ае, М. xenopi, М. gordonae и 5-дневные культуры производственных штаммов 4, 19, 64, 128, идентифицированные как М. fortuitum, М. smegmatis, М. phlei. Эти культуры были выделены от животных, реагирующих на туберкулин, но без специфических поражений, характерных для туберкулеза. Культуры микобактерий туберкулеза бычьего вида (шт. 14, 92) получены от крупного рогатого скота с туберкулезными изменениями в заглоточных и подчелюстных лимфатических узлах. Остальные культуры - музейные.

Изучение патогенных и сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий, наиболее часто выделяемых от крупного рогатого скота, проводили на 27 клинически здоровых телятах 4-месячного возраста, не реагирующих на туберкулин для млекопитающих и КАМ, со средней массой тела 92 кг.

Животных разделили на 8 опытных и одну контрольную группы, по 3 головы в каждой. Для заражения телят использовали 5-дневные культуры М. fortuitum шт. 19, М. smegmatis шт. 129, М. phlei шт. 128, 2-недельную культуру М. avium шт. 163, выращенные на среде Левенштейна-Иенсена, а также эти же штаммы микобактерий, изолированные в лабораторных условиях с тест-объектов после их дезинфекции 3%-м щелочным раствором формальдегида. Телят 1, 2, 3 и 4-й групп заражали М. fortuitum, М. smieg-matis, М. phlei, М. avium, телят 5, 6, 7 и 8-й групп - культурами этих же микобактерий, подвергавшихся воздействию дезинфектанта. Культуры суспендировали в 10 мл физиологического раствора и вводили однократно интратрахеально в дозе 2 мг на 1 кг массы тела животного с предварительным введением в трахею 5 мл 5%-го раствора новокаина. Телятам 9-й группы (контрольной) вводили стерильный физиологический раствор в объеме 10 мл. Телят содержали в изолированных боксах.

Динамику аллергической реактивности телят проверяли симультанной пробой через каждые 30-45 дней в течение 226 дней (срок наблюдения) согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» (1986). Павших и убитых животных подвергали тщательному патолого-анатомическому исследованию. Отобранный на вскрытии материал исследовали бактериологическим и гистологическим методами. Гистологические исследования выполнены старшим научным сотрудником лаборатории патологической морфологии ВНИИБТЖ, кандидатом биологических наук К.Г. Щелкановым.

Субмикроскопическую организацию атипичных микобактерий изучали по методике A. Ryter, Е. Kellenberger (1958) совместно с научными сотрудниками лаборатории химикофизических методов исследования ВНИИБТЖ Б.И. Коганом и Л.В. Гежес. В работе использовали 5 культур микобактерий: М. xenopi, М. intracellularае, М. fortuitum, М. smegma-tis и производственный штамм № 12, идентифицированный нами как М. phlei. Из культур, выросших на среде Левен-штейна-Йенсена, готовили суспензии, которые стандартизировали по бактериальному стандарту мутности - 500 млн микробных тел в 1 мл среды, а затем разводили физиологическим раствором 1:10. В яичную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмала (так как он адсорбирует лекарственные препараты), до свертывания добавляли изониазид в концентрациях 0,1; 1,0; 5,0; 10,0 мкг/ мл среды. Питательную среду с различными концентрациями препарата разливали в пробирки по 5 мл и свертывали в наклонном положении в течение 15 мин при температуре 85°С, не допуская ее перегревания. В качестве контроля использовали рост культур на среде без добавления изониазида. Суспензии, приготовленные из каждого штамма микобактерий, в объеме 0,2 мл высевали на 15 пробирок (по 3 на каждое раз-ведение препарата и контрольных). Пробирки с посевами помещали в термостат при температуре 37°С. Для оценки интенсивности и скорости роста исследуемых культур посевы просматривали ежедневно. Оценку и учет выросших колоний проводили по 4-балльной системе (по Г.Н. Першину).

Для электронной микроскопии материал (колонии) фиксировали раствором глутарового альдегида и осмия, обезвоживали в спирте возрастающей концентрации (от 30 до 100%) и после проведения колоний через промежуточные смеси смол заливали их в аралдит. Залитый материал подвергали полимеризации в разных температурных режимах. Ультратонкие срезы с полученных блоков готовили на ультратоме УМТП-5 и после двойного контрастирования по Рейнольдсу проводили изучение ультраструктуры микобактерий в электронном микроскопе ЭВМ-100Б при ускоряющем напряжении 75-100 кВ.

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >