Материалы и методы исследований

Животные. Исследования проводились на базе НИИ клинической иммунологии СО РАМН и кафедре эпизоотологии и микробиологии НГАУ. Материалом для экспериментальных исследований служили самцы мыши - гибриды первого поколения (C57Bl/6xDBA/2)Fi B6D2F1 9-16-недельного возраста. Количество животных в группах составляло от 8 до 10. Каждый опыт сопровождался контролем интактных животных. Содержали животных в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Культуральные среды и реагенты. RPMI-1640 (НПО «Вектор»), физиологический раствор, забуференный фосфатным буфером pH 7,4 (ЗФР); Kumsai brillant blue (Loba Feinchemie); уксусная кислота; соляная кислота,; комплемент морской свинки (НПО «Биомед», г. Пермь); антитела кролика против цельной молекулы IgG мыши (RAM) (БИОС, Новосибирск); Tween 20 («Sigma»); этиловый спирт; мурамилдипептид («Sigma»); 96-луночные круглодонные планшеты для культивирования Linbro (Flow).

Гонадэктомия. Опытным мышам проводили гонадэк-томию открытым способом с использованием Zooletil™ в качестве наркоза в дозе 5 мг/кг.

Подсчет количества лейкоцитов и лимфоцитов. Для подсчета абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови 5 мкл крови разводили в 20 мкл 5%-го раствора уксусной кислоты (разведение 1:20). Определение числа лейкоцитов проводили в камере Горяева. Расчет производился по формуле

v Лх20 .

X— ----------= Ах5 0,

1600x1/4000

где X - количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А - количество лейкоцитов, подсчитанное в 100 больших квадратах; 20 - степень разведения крови; 1600 - количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (100x16=1600); 1/4000 - объем счетной камеры( 1/4000 мкл).

Для подсчета относительного количества лимфоцитов мазок крови фиксировали в спирт-эфирной смеси (1:1) 20 мин, окраску мазка крови проводили по Романовскому -Гимза.

Выделение клеток селезёнки, лимфоузлов, тимуса. Мышей забивали дислокацией позвоночника. Обрабатывали 70%-ым этиловым спиртом и помещали на стерильный анатомический столик. В средней части делали небольшой поперечный разрез шкуры и раздвигали её по направлению к конечностям. Обнажившуюся брюшную полость вскрывали в верхней трети, тупо, при помощи пинцетов, выделяли селезёнку. Тимус извлекали путём срединного (продольного разреза) верхней части грудной клетки и вскрытия грудной полости. Селезёнку, тимус помещали во флакончики со средой, расстригали ножницами, многократно пропускали через шприц с иглой, фильтровали через металлическую сеточку и 2-3 раза отмывали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин со сменой среды. Осадок клеток селезёнки, тимуса ресуспендировали в полной среде и подсчитывали их общее количество.

Получение сыворотки крови. У мышей забор крови проводили декапитацией. Ножницами декапитировали животное, кровь собирали в пробирку.

Пробирки с кровью центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин. Сыворотку или плазму собирали и хранили в пробирках для микропроб при температуре -20°.

Определение массы и количества ядросодержащих клеток тимуса и селезенки. Массу, общее количество клеток тимуса и селезенки определяли в динамике: через 5 и

12 недель после гонадэктомиии. Мышей забивали методом дислокации шейных позвонков. Массу тимуса и селезенки определяли путем взвешивания.

Количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки подсчитывали в камере Горяева и рассчитывали по формуле

Ki =

Лх20 1600x1/4000

х4,5;

тг Лх200 К2=-----------х4,5,

1600x1/4000

где Ki - количество ядросодержащих клеток тимуса; Кг- количество ядросодержащих клеток селезенки; А - количество клеток, подсчитанное в 100 больших квадратах; 1600 - количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (100x16=1600); 1/4000 - объем счетной камеры (1/4000 мкл); 20 - степень разведения клеток тимуса; 200 -степень разведения клеток селезенки; 4,5 - объем (мл) суспензии тимуса (селезенки).

Определение уровня первичного гуморального ответа (IgM и IgG-AOK) на Т-зависимый антиген (эритроциты барана ЭБ). Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса М, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана в дозе 107/ мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом A.J. Cunningham (1968). У мышей после дислокации шейных позвонков извлекали селезенку и помещали в пенициллиновый флакон с 0,5 мл среды 199. Каждую селезенку помещали в отдельный флакон. Все процедуры с клетками проводили на льду. Объём клеточной суспензии доводили до 4,5 мл. Клетки разводили средой 199 в 5 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 500 мкл суспензии селезенки, 500 мкл суспензии эритроцитов барана, 500 мкл комплемента, предварительно разведённого в 5 мл среды. Компоненты перемешивали и смесь заливали в стеклянные камеры (по 2 камеры на каж дое животное, учитывая среднее), сделанные из двух предметных стёкол, склеенных смесью воска с парафином вдоль продольных сторон. Учитывали объём камеры. Камеры помещали в термостат и инкубировали 1,5 ч при +38°С. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной

лупой (увеличение х 42)

Абс.АОК =

kAOKxVksxR

Vk

где Абс. АОК - абсолютное количество антителообразующих клеток; кАОК - количество антителообразующих клеток на камеру;Vk - объем камеры; Vks - объем клеточной суспензии; R- разведение.

Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали согласно методике на пике иммунного ответа на 9-е сутки после внутривенной иммунизации 2%-м раствором эритроцитов барана (Cunningham, 1968). Объём клеточной суспензии селезенки доводили до 4,5 мл. Клетки селезенки разводили в 10 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроцитов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, помещали в термостат и инкубировали 2 ч при +38°С. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой.

Определение вторичного гуморального ответа (IgG-АОК) на Т-зависимый антиген (ЭБ). Для определения вторичного гуморального иммунного ответа проводили внутривенную иммунизацию 2%-м раствором ЭБ в дозе 0,5 мл двукратно с интервалом 30 дней. Объём клеточной суспензии селезенки доводили до 4,5 мл. Клетки селезенки разводили в 200 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроцитов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, инкубировали в термостате 2 ч при +38°С. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой (Sterzl, Riha, 1965).

Оценка клеточного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ). Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа: величины отёка лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным. Для этого предварительно иммунизировали мышей внутрибрюшинно. Сенсибилизирующая доза - 0,25% ЭБ в объёме 0,5 мл (2,5x107 ЭБ/ мышь). Разрешающую дозу -50% ЭБ в объёме 50 мкл (5x108 ЭБ/ мышь) вводили под подошвенный апоневроз задней правой лапы на 4-е сутки. В контралатеральную лапу вводили среду в том же объёме. Учёт реакции проводили через 24 ч по величине местного отёка. Результаты выражали в абсолютных (разность между отёком лапки, в которую были введены ЭБ, и отёком контралатеральной лапки) и относительных единицах (отношение разности между отёком лапки, в которую были введены ЭБ, и отёком контралатеральной лапки к отёку контралатеральной лапки) (Crowle, 1975).

Индукция РТПХ. Хроническую РТПХ осуществляли путём переноса самкам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии DBA/2. Вводили клетки селезёнки, выделенные ex temporo, в стерильной среде RPMI-1640. Каждая мышь-реципиент получала по 150 х106 клеток путём внутривенной инъекции в хвостовую вену в объёме 0,5 мл среды двукратно с интервалом в 5 дней.

Определение белка в моче. О развитии гломерулонефрита судили по стойкому появлению белка в моче. Содержание белка в моче определяли колориметрически с красителем kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie) с помощью

Titertec Multiskan, длина волны 570 nm; калибровочную кривую строили по BSA 100-1000 мкг/мл. На сроке от 8-й до 12-й недели после индукции РТПХ определяли протеинурию. Стойкая протеинурия (уровень белка в моче более Змг/мл регистрировали не менее 3 раз подряд при еженедельном тестировании) свидетельствует о развитии иммунокомплексного гломерулонефрита у мышей, что коррелирует с морфологическим подтверждением болезни.

Определение IgE в сыворотке. Иммуноглобулин Е в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA (BD OptEIA™) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 пт.

Определение тестостерона в сыворотке. Тестостерон в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA (ИФА-БЕСТ™) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 пт.

Морфологический анализ органов мышей-гибридов B6D2F1 как интактных, так и с РТПХ-индуцированной иммунопатологией, проводили методом обзорной микроскопии и общегистологическими полуколичественными методами совместно с сотрудниками Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, канд. мед. наук В.А. Логиновым и канд. мед. наук Л.А. Обуховой. Почки фиксировали в 10%-м формалине при 4°С, обезвоживали и заливали в парафин (Yoshioko et al., 1989; Muracami et al., 1995).

Статистическую обработку результатов проводили методом непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна-Уитни (Гублер, 1978).

 
Посмотреть оригинал
< Пред   СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ   След >